[农学]基因工程2-清华大学.ppt

* 5 基因克隆的酶学基础 （1）核酸内切限制酶（restriction endonucleases） 1）寄主控制的限制(restriction)与修饰现象 (modification) 2）核酸内切限制酶的类型(I型、II型、III型） 3）核酸内切限制酶的基本特性 同裂酶（isoschizomers） 同尾酶（isocaudamer） 4）核酸内切限制酶的命名法 大肠杆菌（Escherichia coli）缩写为Eco 流感噬血菌（Haemophilus influenzae）缩写为Hin 5）影响核酸内切限制酶活性的因素 a. DNA的纯度，b.DNA的甲基化程度，c.反应温度， d. DNA的分子结构，e.核酸内切限制酶的缓冲液 6）核酸内切限制酶对DNA的消化作用 a. 结合模式，b.局部消化，c.消化作用 核酸内切限制酶EcoRI及修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用 核酸内切限制酶HindIII对双链DNA分子的切割作用 具有粘性末端的DNA片段结合方式 碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化 （2）DNA连接酶（Ligase） 1）粘性末端DNA片段的连接 2）平末端DNA片段的连接 a.同聚物加尾法（homopolymertail-joining） b.衔接物连接法（linker） c.DNA接头连接法（adapter） 3）热稳定的DNA连接酶（thermostable DNA ligase） a.寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay） b.连接酶链式反应（ligase chain reaction，LCR）或 连接扩增反应（ligation amplification reaction） a）裂口连接酶链式反应 LCR探针（LCR probe） b）不对称裂口连接酶链式反应（AG—LCR） 应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段 用衔接物分子连接平末端的DNA片段 双衔接物连接法的基本程序 具异常的5’-OH粘性末端结构的BamHI接头的连接机理 寡核苷酸连接测定原理 DNA连接酶链式反应（LCR）原理 不对称裂口DNA连接酶链式反应（AG-LCR）的分子机里 （3）DNA聚合酶（DNA polymerase） 1）DNA聚合酶I a. DNA缺口转移（nick translation） b. DNA杂交探针的制备 2）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记 3）T4DNA聚合酶取代合成法标记DNA片段 4）依赖RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成 5）T7 DNA聚合酶 6）修饰的T7 DNA聚合酶 DNA聚合酶I催化合成DNA合成链按5’—3’方向延长 线性和环形DNA分子的取代缺口转移 用T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA片段末端制备探针 （4）DNA和RNA的修饰酶 1）末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 （terminal deoxynucleotidyl transferase） 2）T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）与DNA分子 5’末端 的标记 3）碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase） 小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase） （5）核酸外切酶（exonucleases） 1）核酸外切酶VII（exoVII） 2）核酸外切酶III（exoIII） 3）入核酸外切酶（入exo）和T7基因6核酸外切酶 * * * *