.基因组序列的诠释.ppt

* * 同源性分析在酵母基因组计划中的应用 酵母基因组大约含有6000个基因， 30％--通过传统遗传学分析得到 70％--通过同源性分析获得 * 二. 实验分析确定基因功能 基因失活 基因超表达 噬菌体展示 （phage display） 酵母双杂交（yeast two-hybridization） 5.2 基因功能的测定 * 基因的功能实现--一个过程，从基因到表型的一系列生理生化反应过程 正向遗传学：传统的遗传分析，从表型出发最终到达基因 反向遗传学：现代基因功能研究方法，与传统遗传分析相反，从基因出发，最终到达表型 基因组计划中基因功能研究：基因到表型。通过系列实验方法鉴别与目标基因相关的表型 基因失活是基因功能分析的主要手段 1.基因失活 * 基因失活 基因剔除（knock-out） 反义RNA技术 RNAi技术 转座子插入突变 * 5.2 基因功能的测定 基因剔除（knock-out）???最简单的基因失活方法，用一段无关的DNA片段取代目标基因。 主要原理：用一段无关的核苷酸序列取代目标基因的中间序列，导入生物体内或目的细胞内，如果该基因所控制的表型发生变化，即从反面验证了目标基因的功能。 * 基因剔除(knock-out) 基因敲除 最简便的基因失活的方法. 1987年建立， 2007年获诺贝尔生理医学奖 主要原理: 在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基因两侧相同的序列, 导入目的细胞,由于同源片段之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色体中. 为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报告基因 基因敲除基本步骤 ES细胞的获得 基因载体的构建　 目的基因导入 筛选靶细胞　 观察生物学性状的改变 * tk 胸苷激酶标记基因 ← gangcyclovir neor 新霉素抗性基因→G418 * 基因敲除技术的应用及前景： ①建立生物模型。 基因功能、代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。 ②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。对于了解疾病的根源、寻找基因治疗的靶目标都有重大意义。 ③.提供廉价的异种移植器官 器官来源稀少是人体器官移植的最大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。异源生物的基因会产生能引起人体强烈免疫排斥的异源分子 福音：将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗 PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a１－３半乳糖基转移酶的基因的２个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生 ④. 免疫学中的应用 异源抗体用于人体时会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。⑤改造生物、培育新的生物品种 基因敲除技术是遗传工程中的另一重大飞跃，为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持 基因敲除技术的缺陷敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能 许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能； 对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究。 * 反义RNA技术??? 反义RNA由基因的负链（模板链的互补链）编码，与正义RNA (sense RNA)或DNA 编码序列结合,干扰mRNA 的转录、加工和转运,干扰基因的表达 ???将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 → 转化目标生物 →获得转基因个体或品系 → 分析转基因个体在生理、生化、形态等方面的变异 → 判别目的基因的功能 * 正义表达载体 反义表达载体 * 反义RNA 作用机理： A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始序列及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。 B 与mRNA 的引导序列结合，阻止核糖体附着，使翻译无法启动。 C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。 * RNAi干扰 转录后水平的基因沉默机制 通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mR