PK15细胞的原代培养传代培养保存实验策划.docVIP

项目一 PK15细胞的原代培养 1.1 方法和原理 原理：原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。/view/585450.htm） 方法：本文采用消化和低渗溶解等步骤分离肾脏细胞；的细胞置DMEM／F 12培养基、37、5％CO2的培养；DMEM／F 12培养基、37℃、5％CO2DMEM／F 12培养基用乙醚麻醉，无菌开腹取肾，在生理溶液中反 复剪碎后，吸入无菌试管内，室温下28 离心5 min，弃上清分别用10 ml生理溶液和10 ml小牛血清溶液洗涤两次ML左右培养基，取一新吸管对其进行吹打，动作一定要缓慢，然后静置1-2分钟，吸上清过滤，将滤液摇匀取一定量的滤液进行细胞计数； （6）根据细胞计数情况对滤液稀释到每毫升有2×105个细胞，处理培养基的最后一滴并盖好瓶塞（方法同上），分装细胞培养液时，加液量为培养瓶的十分之一然后加盖用封口膜封口，标上细胞名称、时间、操作人名等信息，放入37℃二氧化碳培养箱中培养； （7）培养前观察，培养两小时观察一次，以后每天观察一次。 1.4 注意事项 第（1）步 DMEM／F 12培养基随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。/view/542619.htm） 方法：从显微镜下观察到由于PK-15细胞生长时营养与空间不够，血清颜色由红变黄，就需要进行传代培养。用胰酶对对原代贴壁细胞进行消化，然后稀释至2×105个细胞，分瓶稀释的细胞置DMEM／F 12培养基37℃、5％CO2Pk15细胞、DMEM／F 12Ph7、2的PBS溶液、吸管、0..25%的胰蛋白酶、酒精棉球、废液缸、镊子、火柴、喷壶、无菌操作台、移液枪、枪头、吸管、吸管架、瓶架、酒精灯、培养瓶（盖）、记号笔、倒置显微镜、计数板 2.3 方法步骤 （1）准备实验所需的器材，按一定的顺序放入超净台内：左手用的东西放在左边，右手用的东西放在右边，最后用的东西放在最后面。瓶架和试管架放入超净台是应用酒精棉球擦拭一下，然后打开紫外灯进行灭菌30分钟； （2）关闭紫外灯，打开风机，用酒精喷壶对手和要放入超净台的含10%犊牛血清的DMEM培养基瓶、0.25%胰蛋白酶瓶、PK15细胞和培养瓶进行喷淋，然后放入超净台，点燃酒精灯，并再次用酒精棉球对其进行擦拭； （3）用酒精棉球擦拭PBS瓶塞后，再用镊子打开瓶塞（每打开一层用酒精擦拭一遍），瓶口和瓶塞在酒精灯上烤一下，PBS瓶放在瓶架上，瓶塞倒着放，打开吸管装上吸球放在试管架上，再打开装有pk15细胞的培养瓶的瓶塞（方法同上），然后到出旧培养液，最后一滴用酒精棉球吸去，从细胞背面加PBS适量洗涤两次并从背面倒出； （4）打开胰酶瓶塞（方法同上），用移液枪或吸管加胰酶（培养瓶体积百分之一）从细胞背面加入培养瓶中进行消化，放在倒置显微镜下观察，当细胞收缩变圆时消化完成； （5）将手和PK15培养瓶用酒精喷壶喷淋后放入超净台，放入超净台后再用酒精棉球擦拭培养瓶，打开瓶塞倒出消化液（最后一滴的处理同上），放置2-3分钟（根据先倒出那一个就先吹打那个），（在放置的期间准备好培养基和吸管），然后加培养基（原来的一倍），进行吹打，动作一定要缓慢，待细胞分散后去一定量的细胞悬液进行计数根据细胞计数情况对滤液稀释到每毫升有2×105个细胞，处理培养基的最后一滴并盖好瓶塞（方法同上），分装细胞培养液（根据经验每瓶原代PK15细胞可分成2-3瓶），加盖用封口膜封口，标上记号年、月、日、细胞名称、从那瓶分出来的等； （6）放入37℃、5％CO2用甘油或二甲亚(DMSO)作保护剂制备细胞悬液﹐分装入无菌安瓿瓶﹐每管0.2毫升﹐然立即放入液氮生物贮存罐中气相(-150)保存。恢复培养时﹐先直接侵入3水浴中解冻 5～10分钟﹐再种植于适宜培养基内培养。这是根据在低于-130时一切生化反应处于停止状态﹑微生物也不能进行代谢活动而设计的冻结法。为避免冻死﹑冻伤和细胞内形成大量冰晶﹐用保护剂制备悬液并控制预冻时的冷却速率和解冻时融化速率。微生物的大多数属种适于慢速冻结和快速解冻。/view/1131585.htm） 3.2 试剂及仪器 对数生长期的Pk15细胞、生长液、Ph7.2的PBS溶液、吸管、0..25%的胰蛋白酶、冷冻保护液、酒精棉球、废液缸、镊子、火柴、喷壶、无菌操作台、吸管、吸