008罗氏药敏操作规程.doc

广州市胸科医院检验科 结核菌实验室作业指导书 罗氏药敏操作规程 文件编号: GC-JY-CZ-JH-008 版本： 生效日期: 页 码:第1页,共6页 1目的：规范分枝杆菌罗氏药物敏感性（比例法）的操作，使结果更具可信性。 2适用范围：广州市胸科医院检验科临床微生物结核病实验室。 3培养基制备 3.1基础培养基 3.1.1基础液 KH2PO4 2.4g 柠檬（枸橼）酸镁 0.6g MgSO4 7H2O 0.24g 天门冬素 3.6g 丙三醇 12ml 蒸馏水 600ml 注：3.6g天门冬素可用谷氨酸钠（纯度≥99%）7.2g代替，加热溶解，121℃20min灭菌，备用。 3.1.2孔雀绿溶液 孔雀绿染料 2.0g 无菌蒸馏水 100ml 37℃温箱放置1～2小时助溶。孔雀绿液不能长期保存，如出现沉淀或颜色变浅，都应废弃并制备新鲜溶液。 3.1.3全卵液的匀化 将新鲜鸡蛋用洗洁精刷洗干净后于75%乙醇中浸泡30min，晾干后使用。以无菌操作方式制备匀化全卵液，并用双层无菌纱布过滤去除不能匀化的膜状物。 3.1.4培养基的配制 在超无菌条件下将下列成分倒入一个大的无菌烧瓶中充分混匀 基础液 600ml 孔雀绿溶液 20ml 匀质全卵液 1000ml 充分混匀后的培养基溶液静置30～60 min，然后分装在无菌螺旋盖培养瓶内，注意拧紧盖子。每支量约10ml以培养基斜面高度占试管的2/3，且底部充满培养基为佳。培养基分装结束后要尽快（15 min内）开始凝固过程，以防沉淀发生。 广州市胸科医院检验科 结核菌实验室作业指导书 罗氏药敏操作规程 文件编号: GC-JY-CZ-JH-008 版本： 生效日期: 页 码:第2页,共6页 3.1.5培养基凝固： 培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升至85℃，培养基放入后待温度达到85℃时开始计算时间，凝固50min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却。凝固好的培养基斜面呈鲜艳的黄绿色，表面光滑无泡，具有一定的韧性和酸碱缓冲能力。 3.1.6培养基的保存： 质量合格的培养基，注明日期后分装于防潮包装内，4℃保存。保存期不能超过4周。培养基保存前应检查瓶盖有无闭封，防止培养基干化和冰箱凝固水的渗水做成污染。 3.2含药培养基 3.2.1每100 ml基础培养基加入1 ml配制，稀释好的抗结核药液，混匀，无菌分装10 ml/管，85℃凝固50min。 3.2.2抗结核药物溶液的配制和稀释 （1）药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品，并确认纯度和效价，在有效期内使用。（如无法从厂家取得纯品，以临床药品暂代） （2）异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）、阿米卡星（AM）、力克菲疾、莫西沙星（MOXI）、左氧氟沙星（LOFLX）、克拉霉素（CLA）、丙硫异烟胺（TH1321）、利福布汀(RDB)。 3.2.3除RFP、TH1321、RBD用二甲基甲酰胺浴解，再用灭菌蒸馏水稀释外，其他药物可用灭菌蒸馏水溶解、稀释。 3.2.4每种药物按表1所示制成相应药物浓度，再按比例配成培养基药物浓度。 表1含药培养基药物浓度及加入培养基药物浓度表 广州市胸科医院检验科 结核菌实验室作业指导书 罗氏药敏操作规程 文件编号: GC-JY-CZ-JH-008 版本： 生效日期: 页 码:第3页,共6页 药 物 英文缩写 培养基内药物终浓度（μg/ml） 加入培养基前药液浓度 （μg/ml） 异烟肼 INH 0.2 20 利福平 RFP 40 4000 链霉素 SM 4 400 乙胺丁醇 EMB 2 200 阿米卡星 AM 40 4000 力克菲疾 1 100 莫西沙星 MOXI 2 200 左氧氟沙星 LOFLX 3 300 克拉霉素 CLA 20 2000 丙硫异烟胺 TH1321 40 4000 利福布汀 RBD 20 2000 3.2.5培养基的保存：同改良罗氏培养基。 3.3培养基制备的注意事项： 3.3.1在培养基制备间内进行，制备培养基时应有相应原始记录。 3.3.2培养基制备前应对培养基间进行消毒。 3.3.3制备培养基的所有物品均应高压灭菌。 3.3.4 85℃加热是使培养基固化，而不是灭菌，所以，整个操作应在无菌条件下进行。 3.3.5培养基凝固时，温度过高或时间过长都会降低培养基的质量，培养基褪色可能是因为温度过高。培养基表面出现气泡说明凝固有差错。 3.3.6凝固时最好采用蒸汽凝固器，此时培养基