分子克隆常用工具酶.ppt

甲基化酶 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 Dam 甲基化酶可在 GAmTC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。受其影响的酶有Bccll II、MbbooII等。 Dcm 甲基化酶识别 CCmAGG 或 CCmTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受其影响的酶有EccooR IIII等 植物基因工程 基因工程中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 DNA聚合酶I大片段 具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 植物基因工程 植物基因工程 思考题： 载体构建的工具酶主要有那些类型？ 限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制与修饰。核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响其酶活性的因素。 T4 DNA连接酶的性质及用途. Klenow 酶的基本性质及用途。 其他工具酶的用途。 练 习 题 1. 一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 将各限制酶位点绘制在DNA分子上。 ? 2.?另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb ? 3.下图中的一段DNA分子上有两个限制酶PstI和EcoRI识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析EcoRI右侧500bp区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定EcoRI—PstI间的10bp除去后并不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的DNA不能除去 10bp 500bp PstI EcoRI 4. 假如PstI位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？ ? 5. 现有一研究者打算将一EcoRI DNA片段克隆到一个DNA分子的 BamHI 位点以便 DNA 扩增，但扩增后的 DNA 分子又可用BamHI 限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。 ? 6. 一研究生要将一质粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一质粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此实验？ 10bp 500bp HindIII EcoRI H Xb H 5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示： 已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因编码区，现要将此3kb的BamHI片段克隆到另一表达载体pB的BamHI位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？ HindIII