4-转录组学研究方法.ppt

图像扫描 Cy5 Cy3 归一化 差异基因筛选 原理：采用cy3/cy5的ratio值对差异基因进行 判断，或采用统计方法对差异基因进行统计推断。 方法：倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于 0.5 Z值法： Z=(X-μ)/σ 作用：发现两个样本间的差异表达基因，便于后续分析。 基因表达聚类分析 转录组学方法尤其是DNA微阵列的应用导致基因表达数据爆炸性增长。如何对这些数据进行分析，从中提取有意义的生物学信息，已成为转录组学的研究热点和技术瓶颈。 聚类分析技术能将待处理的对象分配到相应的聚类中，使得同一聚类中的对象差别较小，不同聚类之间的对象差别较大。 聚类分析技术在转录组学研究中，非常适合大批量分析基因群的功能。 基因表达聚类的数据表现 Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines. Nature, 2000, Ross et al. 聚类的类型 Hierarchical Clustering Link similar genes, build up to a tree of all K-means Self Organizing Maps (SOM) Principle Component ( PCA ) 因为EST序列是从某特定组织的cDNA文库中随机测序而得到，所以可以用利用未经标准化和差减杂交的cDNA文库EST分析特定组织的基因表达谱。标准化的cDNA文库和经过差减杂交的cDNA文库则不能反应基因表达的水平。 ◆ CGAP 为研究癌症的分子机理，美国国家癌症研究所NCI的癌症基因组解析计划(Cancer Genome Anatomy Project , CGAP)构建了很多正常的或是癌症前期的和癌症后期的组织的cDNA文库，并进行了大规模的EST测序，其中大部分的文库未经标准化或差减杂交处理。 CGAP网站提供了多种工具用以分析不同文库间基因表达的差异, 如： ● Digital Gene Expression Displayer (DGED) ● cDNA xProfiler EST的应用 4：利用EST大规模分析基因表达水平 EST技术流程：一、cDNA文库构建 ◆ 非标准化的cDNA文库的构建。（可用于基因表达量的分析） ◆ 经标准化或扣除杂交处理的cDNA文库。（富集表达丰度较低的基因） ◆ Oligo d(T) cDNA文库。 （非翻译区由于不含有编码序列，与编码区保守序列相比所受到的选择压力比较小，因而其多态性程度比较高，便于多态性位点的选择以用于遗传图谱的构建。 ） ◆ 随机引物cDNA文库。 （所获得的EST在基因功能的鉴定时具有更多的信息含量，并且在构建EST数据库时更有优势，同时有利于利用EST数据库聚类完整的基因和阅读框的寻找，便于利用更敏感的蛋白质比较来寻找同源基因。 ） 二、序列测定及数据分析 随机挑取克隆进行5’或3’端测序 序列前处理 聚类和拼接 基因注释及功能分类 后续分析 EST软件平台 EST序列 库/序列的质量检查 测序量监控 聚类和拼接检查 （借助于基因组信息） 全长ORF寻找 发现全长基因 研究表达基因概况的主要实验手段（DNA chip、proteomics的先驱） 功能分类 表达量分析 SAGE的先驱 交替剪接检测 EST特有信息 测序方向的选择 根据不同的实验目的选择不同的测序方向： ◆ 5’端 5’上游非翻译区较短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基因或研究基因差异表达时用5’端EST较好，大部分EST计划都是选用5’端进行测序的，而且从5’端测序有利于将EST拼接成较长的基因序列。 ◆ 3’端 3’端mRNA有一20－200bp的plyA结构，同时靠近plyA又有特异性的非编码区，所以从3’端测得EST含有编码的信息较少．但研究也表明，10％的mRNA3’端有重复序列，这可以作为SSR标记；非编码区有品种的特异性，可以作为STS标记． ◆ 两端测序 获得更全面的信息。 基因注释及功能分类 注释： ◆ 序列联配 Blastn， Blastx ◆ 蛋白质功能域搜索(二结构比对) Pfam Interproscan 较好匹配 InterproScan Nt Blastn EST sequences Nr Blastx 完成注释 无理想匹配 较好匹配 完成注释 无理想匹配 较好匹配 无理想匹配 New sequences 域的注释 后 续 分 析 常用的基因注释流程 ◆ 手工分类 大部分以Adams 95年的文章中的采用分类体系为标