基因工程实验教材_课件.pptVIP

基因工程实验;实验五 引物设计及PCR扩增靶基因;PCR引物设计;（3）引物3’末端的碱基。引物3’末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是A时，容易发生错配，所以引物3’末端最好不要为A； （4）引物的G+C含量一般为40％～60％，过高或过低都不利于引发反应； （5）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会影响引物与模板的结合。 （6）两条引物的融解温度Tm值尽量不要相差太大，引物的Tm值粗略计算公式为Tm = 4 （G+C）+2（A+T）； （7）引物的5端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物3端是延伸的开始，不能进行任何修饰。;引物设计软件primer premier 5.0的使用;可通过两个方法将序列输入软件中;选择序列文件所在位置; 在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮;Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构 Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体 False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对 Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体;可对引物进行增加或减少碱基;了解并掌握PCR基因扩增的基 本原理; 熟悉PCR基因扩增技术的具体 操作过程 .;一、概述;二