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光滑鳖甲抗冻蛋白表达规律的研究及天然抗冻蛋白纯化初探Expression pattern of antifreeze protein genes and isolation of the natural antifreeze protein from Anatolica polita 硕士 研究生 : 王 晶 专 业 : 生物化学与分子生物学 研 究 方 向 ：昆虫分子生物学 导 师 : 马 纪 教授 研究背景 研究背景 新疆处于亚洲的地理中心，新疆荒漠更是有其独特的气候特点。降水量十分稀少，冬季十分寒冷，年温差和昼夜温差巨大，气温变化剧烈。研究报道，昆虫可以通过表达抗冻蛋白（AFP）来防止低温冻害，那么光滑鳖甲是否同样如此呢？其抗冻蛋白的表达又有什么样的规律呢？光滑鳖甲抗冻蛋白是否拥有比其它昆虫更高的活性呢？ 在实验室前期工作中发现，另一种新疆特有的荒漠昆虫小胸鳖甲其体内抗冻蛋白在炎热的夏季仍有表达，光滑鳖甲是否也表现同样的规律呢？这是否暗示着抗冻蛋白还受到其它因素的调控，或者其除抗冻功能外还具有我们未知的功能？ 为了探明以上问题我们研究了光滑鳖甲不同发育阶段抗冻蛋白基因mRNA水平的变化规律；环境低温对不同发育阶段抗冻蛋白基因表达的影响；探讨光滑鳖甲抗冻蛋白基因季节性表达规律以及各种环境因子对光滑鳖甲抗冻蛋白基因转录和表达的影响；同时还对光滑鳖甲天然抗冻蛋白进行了分离纯化的初探。 研究内容 本研究分为以下四个方面： 光滑鳖甲抗冻蛋白的季节性表达规律 环境因素对光滑鳖甲抗冻蛋白表达的调节 不同发育阶段和低温对光滑鳖甲幼虫抗冻蛋白表达的影响 光滑鳖甲天然抗冻蛋白的分离纯化初探 第一部分 光滑鳖甲抗冻蛋白的季节性表达规律 1.1 样本的采集 样本的采集地点为沙漠边缘地带，这里具有降水量十分稀少，昼夜温差较大，气温变化剧烈的特点。而生活在这种较为极端环境下的荒漠昆虫只能通过战胜长时间的低温，经受剧烈的温度变化，并在夏日克服干旱和高温的影响才能生存下来。光滑鳖甲就是其中的一种。我们记录了采集时间内全年的温度变化，见下图： 1.2 热滞活性(TH)的测定 将提取的昆虫体液通过Fiske? Micro-Osmometer测定其渗透浓度值（Fp），然后将同一样品用蛋白酶K处理后，再次测定渗透浓度值（Mp），求得两者之间的差值，并通过以下公式计算，其中TH为热滞活性值。 TH=(Fp-Mp)×1.858×10-3 1.4 不同季节光滑鳖甲RNA的提取 为了研究光滑鳖甲的季节性转录规律，我们提取了2008年3月至10月采集的光滑鳖甲总RNA结果如下： 1.5 标准曲线的绘制及扩增效率的校正 由于各个基因的扩增效率不同且并不能够达到100%的理论值，为了更准确地检测目的基因的转录情况我们对各基因的扩增效率进行校正，将光滑鳖甲的cDNA倍比稀释10、102、103、104、105、106倍，用三种引物分别对其进行扩增，得到其扩增效率值，三种基因的扩增效率值均为2.19，每次实验得到标准曲线的相关系数R2均大于0.99。 1.5 Real-time PCR 熔解曲线的绘制 熔解曲线是鉴定实验过程中有无样品污染和引物二聚体，PCR产物是否单一且特异的标准。 只有当所得熔解曲线吸收峰尖锐且单一的情况下，PCR所得结果才是真实可信的。结果见下图 1.6 Real-time PCR 熔解曲线的绘制 小结 光滑鳖甲成虫抗冻蛋白基因的表达受到季节变化调节。在初春和秋末ApAFPs的表达量上调说明抗冻蛋白能在温度较低的环境下对昆虫起重要的保护作用。 在炎热的夏季两基因都有明显表达，这暗示光滑鳖甲抗冻蛋白可能存在其他功能。 第二部分 环境因素对光滑鳖甲抗冻蛋白表达的调节 小结 .Apafp752 和 Apafp914受到低温诱导，转录水平随处理时间的延长呈正相关增加。 光滑鳖甲抗冻蛋白mRNA的积累在干旱处理3天时比低温处理3天更高，并且在干旱处理下两基因的表达差异要小于在低温处理条件下的差异。这可能说明两基因对冷和干旱的响应机制是不相同的。 温度变化可以诱导光滑鳖甲抗冻蛋白的表达，这一现像说明抗冻蛋白可能在春秋温度变化较大的环境下对昆虫起重要的保护作用。 第三部分 不同发育阶段和低温对光滑鳖甲幼虫抗冻蛋白表达的影响 3.1 光滑鳖甲幼虫各个发育阶段ApAFPs转录水平的变化及体液THA的变化趋势 为了研究光滑鳖甲幼虫各个发育阶