[理学]03核酸性质.ppt

BIOCHEMISTRY DNA mRNA protein 第14章 核酸的物理化学性质 一、核酸的水解 酸水解 碱水解 酶水解 mRNA→cDNA 限制性内切酶 在细菌中发现有这类酶，主要是降解外源的DNA。 识别双链DNA上特定的位点(4-8碱基对(bp)范围)，将两条链都切断，形成粘末端和平末端。具有极高专一性，数千种。 往往与一种甲基化酶同时成对存在，具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列的能力。 核酸的呈色反应 溴 化乙锭EtBr： ------核酸染料 在300nm波长的紫外光照射下发出590nm荧光。在适当的下，荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。 ★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度（Tm melting temperature ）。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链），A260= 1.37。 当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82～95℃之间。 影响DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性 。 均一性越高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。 ②G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44 ③介质中离子强度 离子强度高，Tm高。 (二)复性 renaturation 变性DNA在适当（一般低于Tm20～25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。 ★复性机制：10～20bp成拉链 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 ★DNA片段越大，复性越慢； ★DNA浓度越大，复性越快。 ★复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。 复性（renaturation） 高于Tm值5℃ 复性 也称退火 （annealing） Cot : 时的Cot值，即指复性完成一半时的Cot值。 (三) 分子杂交 分子杂交的原理示意图 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）。 制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。如：southern印迹法 探针：通常对天然或人工合成 的DNA或RNA片段进 行放射性同位素或荧光标记，做成探针。 原位杂交：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，因未改核酸所在的位置称。 点杂交：将核酸直接点在膜上，再与探针杂交称。 核酸杂交可以在液相或固相上进行 Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜，尼龙膜） 固定（80℃，4-6h） 杂交（高盐浓度，68℃，几小时） Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。 * * 主讲：徐建余 3726374 jianyuxuone@163.com 生物科学系 中心法则 (The Central Dogma) 转 录 翻 译 逆转录 复 制 一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 四、核酸的变性、复性与杂交 上册502页 糖苷键和磷酸二酯键 蛇毒磷酸二酯酶 牛脾磷酸二酯酶 一、核酸的水解 （一）酸水解 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 脱嘌呤： pH1.6，37℃，对水透析 pH2.8，100℃，1h 脱嘧啶： 98-100%甲酸，175℃，2h 三氟乙酸，155℃，60min （DNA）或80min（RNA） 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成 （二）碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温，0.3～1mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。 DNA抗碱水解 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。 （三）酶水解 非特异的磷酸二酯酶：phosphdiesterase 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5′-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3′-核苷酸 特异的磷酸二酯酶：nuclease