绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数.doc

实验一 绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数 实验目的 通过紫外吸收光谱的绘制和摩尔吸光系数的测定，掌握Agilent8453 UV-Vis的使用方法。 学习导数光谱计算方法及特点。 实验原理 本实验用Agilent8453型分光光度计绘制氨基酸（苯丙氨酸，色氨酸 ）的紫外吸收光谱，找出它的吸收峰波长并计算摩尔吸光系数。 苯丙氨酸 色氨酸 紫外分光光度法是利用物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，波长范围为200-400nm的紫外光谱。 各种分子都有其特征的吸收光谱，即吸光度与摩尔吸光系数随波长的变化而变化的规律。吸收光谱的形状与物质的特征有关，以此进行定性分析。 为了清楚地描述各种物质对紫外区域电磁辐射的选择性吸收的情况，往往需绘制吸收光谱曲线，即吸光度对波长的曲线。在吸收光谱曲线上可以找到最大吸收峰波长。 根据比尔定律： A = εb c 式中A—吸光度 ε—摩尔吸光系数 b—液槽厚度，单位：cm c—摩尔浓度，单位：mol/l 摩尔吸光系数可按下式计算： 导数分光光度法：利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。利用导数光谱进行分光光度测定，称为导数分光光度法。通常可以获得1-4阶导数光谱。在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度c保持线性关系：。其中s为导数的阶数。因此，可以利用导数光谱进行定量测定。 导数光谱可用于放大图谱间差别，定性分析中分辨重叠谱带，而且还可以减少定量分析中来自散射、基体、及其它吸收物的干扰影响。由于导数光谱灵敏度高，因此对于试样纯度检验，多组分混合物的测定，消除共存杂质的干扰和背景吸收，测定混合式样都具有特殊的优越性。 实验仪器和试剂 Agilent8453 UV-Vis分光光度计; 移液枪(德国BRAND公司生产); 50ml容量瓶2支; 废液池（烧杯）一只； 氨基酸储备液：色氨酸0.400 g/l，苯丙氨酸2.00 g/l; 去离子水 实验步骤 吸收光谱的测定 （1） 用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为40mg/l, 苯丙氨酸800mg/l； （2） 分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm—400nm间测定他们的吸收光谱。 导数光谱：应用软件中的Math下的Derivate功能，设置参数，分别计算出两种氨基酸标准溶液的1阶导数光谱图。 数据处理 以λ为横坐标，A为纵坐标作出吸收光谱 根据ε=，先在吸收光谱上找出峰值波长及相应的吸光度，然后计算试液的摩尔浓度，注意浓度换算。 一阶导数光谱的绘制：对于测量到的一组波长等间隔的吸光度值，可用窗口移动多项式最小二乘拟合求导法获得对应波长的导数值： （1） 式中j为数据序列中的次序(第j个点)；C为卷积系数，为一矢量；N为归一化因子；2m+1为窗口宽度；△x为变量的间隔(这里为波长)，其上标s为导数的阶数。计算一阶导数时(s=1)，常用二次多项式进行拟合。则卷积系数C中第i个元素为：Ci＝i，(i＝-m,-m+1,…,m-1,m)。而归一化系数为。 例如取m = 3(窗口宽度为7)时，C＝（-3，-2，-1，0，1，2，3），N = 28。这样的参数代入式(1)计算所得，即为一阶导数光谱。 要求对测得光谱计算一阶导数光谱，并作图。 图1. 色氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱图 如图1，色氨酸在276nm处有最大吸收峰，A=1.23;苯丙氨酸在258nm处有最大吸收峰,A＝0.72。 图2. 色氨酸和苯丙氨酸的一阶导数光谱图 讨论与思考 比较导数光谱和吸光度光谱的区别，说明导数光谱的作用。 一阶导数光谱的峰值，对应于原光谱的什么位置？原光谱的峰值所得的一阶导数值为多少？ 为什么色氨酸的最大吸收波长比丙氨酸大，且摩尔吸光系数也大得多？ 补充实验：测定苯蒸气的紫外吸收光谱 一．实验步骤： 取一干燥的1cm石英比色皿，以空气作参比，在波长范围为190nm——300nm间扫空白。 加一滴苯在上述比色皿中，快速盖上盖子，待1～2min后再测定它的吸收光谱。 二．讨论与思考： 1．请查阅文献，并指出文献上所提到的苯的吸收峰的波长。 2. 为什么苯在这个波长处有吸收峰的出现，即发生了什么跃迁？ 3. 为什么用紫外分光光度计无法测得苯的精细结构？ 实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量 一. 实验目的