12、第二节 扫描电镜冷冻割断样品制备技术.pptVIP

* * 第二节 扫描电镜 冷冻割断样品制备技术 一、原理 用冷冻割断法制作出的扫描电镜样品，可以在扫描电镜下观察到细胞器在细胞内的空间分布情况；某些细胞器在特定的细胞内所含数量的多少、以及一些膜性结构的细胞器（如粗面内质网、高尔基氏体等）被割断后的形态结构特点。 冷冻割断样品的制备是将用锇酸固定的生物样品，经二甲基亚砜防冻处理后，用深低温冷冻剂液氮进行冷冻，采用人工的方法对样品进行割断，然后经过基质的软化处理（主要是用低浓度的锇酸浸泡割断后的样品，使细胞基质溶解掉， 只保留下膜性结构），再经清洗、脱水、置换、临界点干燥、粘托和导电处理后，既可进行扫描电镜观察了。 二、实验用品 1、实验用器械：临界点干燥器、离子溅射仪、塑料保温筒（或专用保温筒）、止血钳、铝或铜质的样品冷冻盘（要求深度1～2cm，直径5cm左右）、单面或双面刀片，小木槌和镊子等。 2、化学试剂：1％的锇酸、0.1％的锇酸、25％的二甲基亚砜、50％的二甲基亚砜和双蒸水等。 三、样品制备的技术程序与方法 1、取材与固定：取新鲜的动物肝脏或胰腺末房，切成细条状迅速放入1％的锇酸中固定2小时。 2、洗涤：用0.1mol／L（PH7.2）的磷酸缓冲液洗数次，时间约为2小时。 3、样品的防冻处理：用25％的二甲基亚砜（生理盐水配制）浸泡样品2小时，25％的二甲基亚砜处理2小时，50％的二甲基亚砜浸泡样品1小时。 4、样品的冷冻与割断：先将保温筒内加入液氮，直至停止沸腾；再将样品冷冻杯放入保温筒的液氮内，直至停止沸腾；然后用小镊子夹样品放入冷冻杯内，并迅速在样品表面滴加一小滴50％的二甲基亚砜溶液，这时液滴和样品迅速固化成为一体；再用止血钳夹持刀片，放入液氮内冷冻至停止沸腾；然后持止血钳将刀刃对准样品的中间，用小木槌轻敲刀背，样品以脆性断裂方式断为两半，样品的割断结束。 冷冻割断装置 及其样品的割断过程示意图 从现在开始，在以后的处理过程中，不能对样品的割断面造成任何的机械损伤了。 5、使被割断的样品恢复室温并进行清洗：将割断后的样品用冷的镊子小心的夹持到室温的50％的二甲基亚砜溶液中，直至完全恢复到室温。然后用0.1mol/L的磷酸缓冲液清洗样品，经过多次更换新鲜的液体，直至将二甲基亚砜完全清洗掉，时间约为6～12小时。 6、细胞基质的软化：用0.1％的锇酸浸泡样品36～72小时，中间换1～2次新鲜的液体。 7、样品的后固定：再用1％的锇酸对样品固定2小时，经双蒸水清洗数次，每次30分钟～1小时。 8、样品的脱水：用30％、50％、70％、80％和90％的酒精水溶液对样品进行脱水，每级10～20分钟，纯酒精脱水2次，每次20分钟。 9、置换：用2：1的纯酒精和醋酸异戊酯混合液浸泡样品10～20分钟；再用纯酒精和醋酸异戊酯等量混合液浸泡样品10～20分钟；纯醋酸异戊酯处理样品10～20分钟。 10、样品的干燥处理：干燥方法同常规样品制备方法，也是用临界点干燥法。 11、粘托：用导电胶将样品粘到样品托上（注意：割断面向上，一定不能对割断面造成任何的机械损伤）。 12、扫描电镜观察。 *