免疫共沉淀研究蛋白质间相互作用的技术.pptVIP

免疫共沉淀（Co-IP ） ——研究蛋白质间相互作用的技术 05级生化专业：毛赟赟 蛋白质相互作用的类型有牢固型互作和暂时型互作两种。互作力既可以强，也可以弱。 牢固型互作以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitatio）、Pull-down或Far-western法研究。 暂时型蛋白质相互作用，被认为是涉及到胞内大部分生物过程，包括蛋白修饰、转运、折叠、信号转导和细胞周期等，属于开/闭性质，可以通过交联或标记转移法来研究。胞内研究蛋白质互作的方法除上述方法外，还有蛋白芯片、核磁共振、质谱、X-射线晶体衍射等 。 1 Co-IP的原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质—蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 2 方法 1) 收获培养的细胞（1×107－1×108）冷PBS洗涤2次细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min 2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min 3)收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h 4) 加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液， 4℃摇动免疫沉淀物30 min 5)用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次 6)吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min 7)将样品加入到大孔的不连续SDS梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜 8)通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带 9)从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min 10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱 11)通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。 3 注意的问题 1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。 3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 4 应用 通常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合产生相互作用。 用于验证确定某种特定蛋白质的新的作用搭档。 5 优点 1） Co-IP是检测蛋白质间相互作用的经典方法，在此方法中,蛋白质及复合物均以天然状态存在，符合体内实际情况，能更真实的反映出蛋白质间的相互作用情况，得到的蛋白可信度高 2）抗原与相互作用的蛋白质以细胞中相类似的浓度存在,避免了过量表达测试蛋白质所造成的人为效应。 6 局限性 1）此方法本身具有一定的风险,因为所选择靶蛋白的相关蛋白在此细胞株中可能没有明显差异这就需要实验前做好充分的准备,并根据亚系间不同的生物学行为来正确的选择靶蛋白 2）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质—蛋白质相互作用。 3）不能给出动态的结果，同时也还应该排除细胞在破碎时导致本来没有相互作用的蛋白质发生凝聚的可能性 4）所得的蛋白质有可能不是直接相互作用的蛋白质,而是通过第三者间接相互作用的蛋白质 利用免疫共沉淀（CO-IP）技术、酶联免疫（ELISA）都可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。 * * 免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题 免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题