siRNA在细胞内基因表达沉默的方法.docVIP

siRNA在细胞内基因表达沉默的方法 在细胞内表达siRNA引发基因沉默 RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能，常见的做法是将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(small interfering RNAs)，或者是45—50-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。尽管细节各有不同，但载体大都是用PolIII启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用PolIII启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有PolIII 启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种方法的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起化学合成来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。因为质粒的价钱大约是3000多人民币，还不到化学合成1条21nt的RNA价格的一半，