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细胞传代方法 贴壁生长：采用酶消化法传代。 悬浮生长 离心法传代 直接传代法 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 * 注意事项 传代时机的选择 取决于原代培养的方法（分离活细胞的数量和细胞损伤程度），培养物的细胞活性（细胞离体时间、体内增殖快慢）、细胞类型和特点（肿瘤细胞比正常细胞易于生长）、接种的细胞密度（浓度太低，细胞不易增殖）、培养条件（培养基、血清、温度、湿度、CO2等） * 在某种意义上讲，传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并行原代培养的程度。 传代对细胞生长和性状是有影响的，在必要性不强的情况下，少传代为上 传代次数不等于细胞分裂次数，也不等于细胞的代数，仅仅指传代操作的次数 * 细胞系的建立 正常细胞系建立的程序： 原代培养 第一次传代 常规传代 冻存、复苏 * 培养细胞的纯化 ⑴自然纯化： 利用某种细胞增殖优势排挤其它细胞 无法人为选择，时间长，适于恶性肿瘤 * ⑵人工纯化： 酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同。 机械划除法：用橡皮刮子或弯头滴管直接从瓶壁刮除。 反复贴壁法：利用上皮细胞和成纤维细胞贴壁时间和稳定性不同。 培养基限定法：某些细胞在生长过程中必须存在或去处某种物质。 流式细胞仪分离法：利用细胞核酸含量，某些物质含量或细胞结构大小等参数分离。 * 原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期 * 建立细胞系的要求 种属和组织来源 细胞生物学检测 培养条件和方法 * 细胞系鉴定 当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定 后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等 方面的研究。 细胞系的细胞来源 细胞有无交叉污染，除了主类细胞外，还杂有哪类细胞 * 细胞系的稳定性，即在细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化 累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等 细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化 * 细胞系鉴定指标 (1)形态学： 光镜，电镜 (2)染色体分析： 采用染色体数目、核型分析及染色体分带技术 鉴定细胞系的种属、性别来源； 检查细胞系是否趋于稳定，有否发生转化； 区别正常细胞与恶性细胞 * (3)同工酶谱： 在不同种系的细胞和同一种系不同组织之间同工酶表达多型性，正常和恶性细胞之间也有不同 通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶，根据条件选择 (4)细胞DNA指纹技术: 判断建立的细胞系来源 (5)抗原标记: 鉴定细胞来源 (6)细胞生长实验:在免疫缺陷小鼠上无浸润生长，不形成肿瘤；培养的细胞具有接触抑制，饱和密度、停泊依赖等生长特点 * 鉴定、管理和使用 按国际惯例，在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。 各国管理中心、细胞库 美国标准细胞库ATCC(American Type Culture Collection)、人遗传突变细胞库HGMR、细胞衰老细胞库CAR * ATCC入库细胞要求检测项目（基本要求）： 培养简历：组织来源、日期、物种、供体情况、细胞传代情况等 冻存液：培养基和防冻液名称 细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性 培养液：培养基种类和名称、血清来源和含量 细胞形态：类型 * 核型：二倍体或多倍体，标记染色体的 有无 无误染测验：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等 物种鉴定：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染 免疫检测：一两种血清学检测 细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名 * 细胞克隆 克隆（clone）: 指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。 细胞克隆化培养（cell cloning culture）:指将单个细胞在一定支持物上（如软琼脂或甲基纤维素）增殖培养而产生的细胞群落。 有均一性 * 稀释铺板：用足够体积的培养液稀释细胞悬液，使铺板后呈单细胞分布（一般稀释，梯度稀释） 贴壁依赖细胞的克隆：将稀释的细胞接种到适当的基质上，使单个细胞在基质上固着、繁殖生长，形成细胞群落。然后再取单个细胞群落进行再培养。 非贴壁依赖细胞的克隆：将稀释的细胞接种入含有琼脂或琼脂糖的培养液内,借助琼脂凝固而使细胞固着。在琼脂培养基内细胞生长成群落，再取单个群落进行再培养 * 克隆培养技术 稀释铺板法（10-100cells/ml） 饲养层克隆法 常用的有成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞 胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法 琼脂克隆法 在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化 * 稀释铺板克隆法图