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利用Streptomyces hygroscopicus發酵生產免疫抑制劑 Rapamycin之探討 研究生：蕭欣培 指導老師：顏宏偉 摘要--本研究利用放線菌Streptomyces hygroscopicus發酵生產rapamycin免疫抑制劑之探討，目的希望找出較佳的發酵環境以及發酵控制，提高產物rapamycin的生產濃度與生產速率。先以三角搖瓶進行較佳發酵環境的選定，再放大至5L發酵槽進行發酵控制與監測並探討與改良。在三角搖瓶方面，結果指出培養基中的碳源方面以葡萄糖(glucose)較佳，而氮源則以酵母萃取物(YE)有較佳的產物生成。然而在5L發酵槽的培養方面，發現採用兩階段溶氧策略控制，有助於提升產物產量，從空白組的最大產量104 mg/L增加至288 mg/L，提升了177%；DO50%高溶氧下，更能使產物產量增加，從空白組的最大產量104 mg/L增加至782 mg/L，提升了652%。然而在pH的變化中，發現對於產物生成似乎極為重要，並做了兩段式調控pH來進行實驗測試，發現第二階段控制pH為5.5時，可以提高產量至570 mg/L，相較於控制組濃度104 mg/L增加了約448 %；放大至15 L發酵槽下，以同樣條件培養，可以提高產量至683 mg/L，相較於控制組濃度104 mg/L增加了約557 %。由以上結果得知，在S.hygroscopicus的發酵培養裡，產物的生成與溶氧量和pH值的改變有相當大的關聯，在未來實驗裡將對溶氧與pH的影響性進行更深入的探討。 關鍵字：放線菌、S.hygroscopicus、免疫抑制劑、rapamycin 一、緒論 1-1 前言 1975年，放線菌S. hygroscopicus在復活節島上的土壤被發現，而菌體的發酵液中分離出rapamycin這物質，早期一直被當作治療真菌之感染，相繼研究出具有免以抑制劑、抗腫瘤、防止衰老延長壽命等多種效能。它的結構與另外一種Streptomyces的代謝產物FK506非常相似，且具有免疫抑制活性，在器官移植和自體免疫疾病的臨床實驗方面感到很大的興趣（Sung et al., 2010）。在市場調查中指出1997年全球免疫抑制劑市場為13億美金，至2005年市場增加為19億美金，目前Cyclosporine-A銷售量最大，第三位為Rapamycin銷售額為2.4億美金（李，2001）。 由於rapamycin之生產製程相當困難，僅少數幾家公司具有生產能力，國內則尚無人能生產此藥物，若能開發出具競爭力生產製程，對國內生技產業能力之提升，將有很大之幫助。目前生產Rapamycin 之製程均是由野生種之Streptomyces hygroscopicus 經醱酵、提取精製、純化而得，然而野生株其生產Rapamycin之能力均甚低，以致生產成本大幅升高，量產困難，因此如何提高菌株之生產能力往往是此類製程能否商業化的關鍵。Rapamycin 之合成是屬多基因調控，所以欲提高生產菌株之產能，很難利用簡單的培養基調整即可達到目的。利用醱酵調控技術及代謝途徑調控等方法，是目前最常被廣泛應用在提高微生物二級代謝物產能之策略。 二、文獻回顧 2-1 菌種介紹 Streptomyces hygroscopicus這菌種，最早是在復活節島上的土壤被取得並分離純化，且被發現有抑制Candida albicans、 Microsporum gypseum和Trichophyton granulosum的生長，然而分離出具有抑制菌體生長活性的物質，被取名為rapamycin（Sehgal et al., 1975）。2-2 Rapamycin介紹 Rapamycin最早是被發現具有抑制真菌的抗生素，是由Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491所生產分離的。它為白色固體，分子式為C56H89NO14，熔點在183~185之間，結構式如下圖（Sehgal et al., 1975）。 22-1 抗真菌 Rapamycin被發表指出具有比其他抑制真菌抗生素還更有較佳的效果，最早指出低濃度的rapamycin可以有效抑制Candida albicans，Microsporum gypseum，Trichophyton granulosum。Rapamycin與amphotericin B 對於抑制各種Candida相較下，rapamycin都有較明顯的抑制較果，在Candida albicans這株真菌測試抑制下，也較nystain和candicidin兩種抗生素有更好的效果（Sehgal et al., 1975）。2-2-2免疫抑制劑 Rapamycin，是新型大環内酯的抗排斥藥物，是目前世界上最新的强效免疫抑制劑，臨床上用于器官