利用单因子和正交设计双重实验法优化鹧鸪茶RAPD-PCR-农学学报.PDFVIP

·14 · 利用单因子和正交设计双重实验法优化 鹧鸪茶RAPD-PCR 反应体系 李娟玲，刘国民，曹嵩晓，罗轶奇 （海南大学苦丁茶研究所，海口570228） 摘 要：为了建立鹧鸪茶RAPD-PCR 的优化反应体系，首先通过单因素试验选定其各影响因子比较适 宜的浓度范围，再利用正交试验设计方法，对影响鹧鸪茶RAPD-PCR 反应的5 种因素进行4 水平优化 试验。并运用SAS 软件对试验结果进行了分析，最后确定优化的RAPD-PCR 反应体系为：10×Buffer 缓冲液2.5 μL+Mg2+ 2.5 mmol/L + dNTPs 0.2 mmol/L + TaqDNA 聚合酶1.5 U + S28 引物0.48 mmol/L + 80 ng 模板，定容至25 μL 。PCR 扩增程序为：94℃预变性4 min ，然后按94℃变性30 s ，38℃退火45 s ， 72℃延伸120 s ，进行45 个循环，最后72℃延伸10 min ；16℃保存。该优化的RAPD-PCR 反应体系具有 良好的稳定性和重现性，可应用于鹧鸪茶不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。 关键词：鹧鸪茶；RAPD ；影响因子；体系优化 中图分类号：Q785 文献标志码：A 论文编号：2011-0404 Optimization of RAPD-PCR Experimental System in Mallotus oblongifolius (Miq.) Muell.-Arg. Using Dual Experiments of Single Factor and Orthogonal Design LiJuanling,LiuGuomin,CaoSongxiao,LuoYiqi (KudingchaResearchInstituteofHainanUniversity,Haikou570228,Hainan,China) Abstract: In order to establish the optimized RAPD-PCR (randomly amplifiled polymorphic DNA- polymerasechainreaction)experimentsystemforMallotusoblongifolius (Miq.)Muell.-Arg.,thesinglefactor experimentwasfirstlyinvolvedtodetectthesuitableconcentrationrangesofdifferentinfluentialfactors,and thentheorthogonaldesignwasinvolvedtooptimizeRAPD-PCRamplificationsystemofM.oblongifoliusin5 2 + factors(Mg ,dNTPs,primer, Taq polymerase,DNAtemplate)at 4 levels,respectively.Meanwhile,the obtaineddatawereanalyzedbysoftwareSAS.AnoptimalRAPDreactionsystemwasfinallyestablished. 2+ Namely, 2.5 μL 10×PCRbuffer, 2.5 mmol/LMg ,0.2 mmol/LdNTPs, 1.5 UTaqpolymerase, 0.48 mmol/L primers,and 80ngDNAtemplatewerecontainedin25 μLreactions