直接计数法血球计数器一、原理微生物大小事监定微生物种类的重要.docVIP

直接計數法 血球計數器一、原理 微生物大小事鑑定微生物種類的重要參考，由於人類肉眼無法直接觀察微生物，因此答大小亦無法用一般的度量工具測量。微生物學家一般使用一個鏡臺測微器(stage micrometer)校準過之接目測微器(ocular micrometer)並配合光學顯微鏡作為量測微生物大小的工具。鏡臺測微器大小與顯微鏡接目鏡相同，中央圓圈內刻有意微尺，長度為1mm，在分為100小格，及每一小格之長度為0.01mm(=10um)；接目鏡測微器則為圓形玻片，大小正適合於接目鏡中，中央刻有極細的100格等距離之刻度。本方法的優點是利用肉眼直接進行微生物菌體大小的量測，而切點微無法分辨微生物之死活，導致量測時產生誤差(活的與死的同種微生物有時大小並不想同)。 以顯微鏡觀察進行微生物大小測量時，接目測微器的每小格大小隨顯微鏡製造商不同與放大倍率的改變而有所不同，因此使用前應先用鏡臺測微器進行校準，其量測步驟包括二個步驟：(一)接目測微器校準1.將接目測微器置於接目鏡鏡筒中。2.測微器置於載物臺上，以低倍鏡對焦。3.轉動目鏡，使接目測微器之刻畫與鏡臺測微器之刻劃平行。4.移動鏡臺測微器，使兩側微器刻度重合成一直線。5.分別讀出兩種測微器兩端重合線間的小格數目。6.由已知鏡臺測微器每小格的長度(10um)換算接目測微器上每小格之長度，其計算如下： 接目測微器每格長度(10um) 7.改變使用鏡頭時如高倍鏡成由鏡，重複上述步驟。(二)微生物大小之量測 將已準備好之微生物試驗標本置於已校準過的接目鏡下，即可量測各種微生物的大小數次，再用算術平均值求出。本實驗讓學生學習如何利用顯微鏡觀察微生物菌體的大小，同時熟悉鏡臺測量與接目測量器的使用。Hemocytometer (血球計數器)介紹二.實驗大致步驟 1.取1克酵母菌粉加入100mL之培養液中，混合均勻2.將菌液進行10倍稀釋至10-3，將不同濃度之菌液在595nm波長，以分光光 度計測其吸收值(通常由低濃度往高濃度測，如此管子不必換) 3.由各不同濃度取1滴菌液，置於血球計數器上，蓋上蓋玻片 4.以顯微鏡觀察，調整至最佳視野(即可見觀測微生物時) ，計算格子內菌數值(要知道大、中、小格之體積大小) ，隨機選擇5格測量，取其平均值。(注意 : 如果此時菌數太多，則要將菌液進一步稀釋，爾後計算再將稀釋倍數調回) 5.推算每mL所含菌數，取log值，並與所測吸光值作圖(至少有3點數據) 6.理論上將可得一直線。 7.保留此數值，在生長曲線實驗時可以用。如已作過生長曲線實驗之組，應以當時所得直線方程式結果，將此次之吸光值，代入，求菌數，比較兩者之結果。 三.設備(一)器材  1.蓋玻片 2.載玻片 3.拭鏡紙 4.玻璃(塑膠)滴管 5.接種環(針)(二)儀器  1.光學顯微鏡 2.接目測微器 3.鏡臺測微器 4.離心機 5.酒精燈 四.試劑與培養基(一)試劑  1. 無菌稀釋水：參考實驗二實驗前準備事項 2. 95%工業酒精：酒精燈燃燒用 五.菌種或採樣來源(一)菌種 1.大腸桿菌 2.枯草桿菌(二)採樣來源 1.池塘或河川水 2.河水處理場生物處理曝氣池之汙水  六.細胞濃度計算大格計算 Volume (體積) =長 x 寬 x 深度 = 1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3 = 1 x 10-4 cm3 (mL) 若該體積有n個細胞，則細胞濃度為 = n個 / (1 x 10-4 mL) = n x 104 個/mL (若有稀釋需再乘上稀釋倍率) 常使用計數ABCD四區域有n個細胞，則細胞濃度為 = n / 4 x 104 （個/mL） 細胞計數時，細胞濃度不要太稀，太稀準確度會比較低，最好在100～300 x 104 個/mL 中格 (E) 計算 Volume (體積) =長 x 寬 x 深度 0.2mm = 0.2 mm x 0.2 mm x 0.1 mm