[自我管理与提升]第三章-初级分离.pptVIP

第三章 初级分离 沉淀、泡沫分离 3.1 沉淀/沉析(precipitation) 是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物（aggregates）的现象。 该固体沉淀物为不定形的固体颗粒，纯度较低。 产物的浓缩！ 特点： 简单、经济、浓缩倍数高。 适用范围： 抗生素、有机酸等小分子及蛋白质、酶、多肽、核酸和其它细胞组分的回收和分离。 3.1.1 蛋白质的表面性质 蛋白质溶液稳定的因素 水化膜层，保护蛋白质粒子，避免因碰撞而聚沉。 双电层，静电斥力作用，使分子互相排斥。 3.1.2 盐析 主要适用于蛋白质（酶）等生物大分子物质，在高浓度中性盐存在下，它们在水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 盐溶（salting-in）少量加入中性盐，蛋白质溶解度增加的现象。 盐析（salting-out）双电层厚度降低，静电排斥作用下降；盐离子的水化作用，脱去蛋白质的水化膜，暴露出疏水区域，容易发生凝聚和沉淀。 在盐析区，溶解度的对数与离子强度之间呈线性关系，符合下式（Cohn经验方程）： lgS=β-KsI S—蛋白质溶解度， g/L; I —盐离子强度， I= ?ΣciZi2 , ci为i离子浓度mol/L，Zi为i离子化合价； β—常数，当盐离子强度为零时，蛋白质溶解度的对数值，与蛋白质种类、温度和pH有关，与无机盐无关； Ks—盐析常数，直线的斜率，与蛋白质和盐的种类有关，但与温度和pH无关。Ks大时，溶解度受盐浓度影响大，盐析效果好。 盐析用盐的选择 一般中性盐的阴离子对Ks的影响更为显著。离子半径小而带电荷较多的阴离子的盐析效果较好，即盐析常数大。常见阴离子的盐析作用顺序为: PO43-SO42-CHCOO-Cl-NO3-ClO4-I-SCN- 阳离子的盐析作用顺序为: NH4+K+Na+Mg2+ 对盐的要求： 盐析作用强； 溶解度大，能配置足够高浓度盐溶液； 溶解度受温度影响小，低温时不至于析出盐晶体； 盐溶液密度不太高，便于蛋白质沉淀的沉降或离心分离； 价格便宜； 惰性无毒，或便于去除。 硫酸铵的缺点： 强酸弱碱盐，pH降低；高pH下放氨；腐蚀性；食品中残留会被味觉感知；临床有毒性，需去除。 温度影响 低盐浓度下，蛋白质的溶解度与其它物质类似，温度升高，溶解度升高。 在高盐浓度下，大多蛋白质的溶解度随温度升高而下降（有助于蛋白质的失水）。 pH影响 接近蛋白质等电点的溶液中蛋白质的溶解度最小（β最小），所以调节溶液pH在等电点附近有利于提高盐析效果。 盐析操作 （1）直接加入硫酸铵固体粉末，加入速度不能太快，分批加入，并充分搅拌，防止局部浓度过高； （2）加入硫酸铵饱和溶液，在盐浓度不需太高时可采用这种方式，可防止局部过浓，但料液会被稀释。 为达到盐析所需的盐浓度，应加入固体硫酸铵的量，可计算，也可查表（硫酸铵饱和度的配制表）。 实验室确定盐析沉淀步骤： 取部分料液，分成等体积数份，冷却至0℃ ； 计算饱和度达到20～100％所需加入的硫酸铵量，并在搅拌条件下分别加到料液中，继续搅拌1h，保温0℃； 离心，沉淀溶解于缓冲液，测定其中总蛋白浓度和目标蛋白浓度（或活性）； 测定上清中总蛋白浓度和目标蛋白浓度（或活性），物料衡算，检验结果的可靠性； 根据蛋白质活性收率和纯化倍数选择合适饱和度。 3.1.3等电点沉淀 蛋白质为两性物质，具有等电点，在等电点pH处蛋白质净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低。利用这一性质，进行蛋白质沉淀分级的方法称为等电点沉淀法（Isoelectric precipitation）。 等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质，而对亲水性很强的蛋白（如明胶），由于其在水中溶解度较大，在等电点的pH下也不易产生沉淀。 通常操作条件为：低离子强度；pH≈pI。蛋白质的等电点多为偏酸性，一般加入无机酸（盐酸，磷酸，硫酸等）调节pH。 优点：很多蛋白质偏酸，无机酸（盐酸、磷酸、硫酸等）通常价廉，且为食品所允许。 缺点：酸化时，蛋白质易失活。 3.1.4有机溶剂沉淀 静电作用： 在两粒子距离和带电都不变的情况下，静电作用和介电常数ε成反比。因此，当加入有机溶剂后，溶液的介电常数下降，导致离子间的静电作用增大而凝聚沉淀。加入