同源区段长度对In.pdfVIP

中国医药生物技术 2013 年 8 月第 8 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 2013, Vol. 8, No. 4 241 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.001 ·论著· 同源区段长度对In-Fusion 技术 连接效率的影响 李慧仙，朱平 【摘要】 [7] 技术（Clontech ） 等。Gateway 技术是基于 λ 噬 目的 在目的基因原载体（DNA 模板）与克隆载体相同的 菌体位点特异重组系统，由 BP 和 LR 两个反应 条件下，探讨了 PCR 扩增片段（含目的基因）的末端与载 构成，两个反应的阳性重组率均可高达 90% 以上， 体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响，并建立以 但会引入多余序列。该技术需要特殊含 attR 位点 In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。 表达载体，Invitrogen 公司提供一系列常用 attR 位 方法 以糖基水解酶 Lxyl-p1-2 （2.4 kb ）基因突变库的构建 点修饰后的表达载体，此外，还可以将目的载体改 为例，设计引物使目的基因的两端分别与线性化载体末端含 造成为 Gateway 表达载体。该技术最大的优势在 有 15 ~ 200 bp 重叠序列，并通过易错 PCR 方法获得含目 于通过 BP 反应构建入门载体后，通过 LR 反应 的基因的 PCR 扩增片段，运用 In-Fusion 技术将 PCR 扩 就可以使插入片段在不同表达载体间快速准确穿 增片段定向克隆至表达载体 pPIC3.5K 中。 梭，便于功能基因的分析和蛋白的表达。In-Fusion 结果 对于长度大约为 2.4 kb 的较大片段 DNA 的克隆， 技术是依赖于 In-Fusion 酶 3 → 5 外切酶活性， PCR 扩增片段的末端与载体间最适同源区段长度约为 经短时间即可在插入片段与载体的同源区段 100 bp，此时连接效率最高，其阳性重组率高达 90% 左右， （homologous or over-lapping sequence ）上形成互补 是常规酶切连接法的 3 倍。与后者相比，该技术将克隆周 的单链黏端，继而在单链黏端之间自发退火形成重 期由 3 ~ 4 d 缩短为 1 ~ 2 d 。 组质粒。In-Fusion 技术适用于任何载体，不需对载 体进行改造，也不会引入多余序列，在设计基因片 结论 优化的同源区段长度可以显著提高 In-Fusion 技术 段的上、下游引物时，两引物的 5-末端分别仅需 对于 2.4 kb 目的基因与载体的连接效率，该方法尤其适用 要 15 个碱基与载体序列相同[8] 。值得注意的是， 于定向进化过程中基因突变库的构建。 与 Gateway 技术相比，In-Fusion 技术连接时只需 【关键词】 定向分子进化； In-Fusion 技术； 同源区 要一步，在定向进化突变库构建应用中降低了多步 段； 高通量克隆 骤连接带来的库容量与丰度的损失。 中国医药生物技术, 2013, 8(4):241-246 但在应用 In-Fusion 技术进行基因克隆时，