[理学]分子生物学常用技术三.ppt

谢 谢！ 反转录人工合成互补DNA 构建基因文库获取目的基因存在的问题—— 费时费事 内含子序列 以mRNA为模板，以短的寡核苷酸（oligo(dT)）分子作引物，加入dATP, dTTP, dGTP和dCTP, oligo(dT)与mRNA分子的多聚A（polyA）尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。接着，在大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下，再以第一条DNA为模板，人工合成另一条互补的DNA子链。这种经过mRNA反转录人工合成的双链DNA被称为互补DNA（cDNA）。在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的mRNA。因此，用cDNA方法获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因 聚合酶链式反应（PCR） PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列；（2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。 聚合酶链式反应（PCR） 变性、退火、延伸三步曲 变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 聚合酶链式反应（PCR） 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得—— 230（1.07×109)个基因片段 Molecular cell biology 4.0 7.7 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态（competent） 感受态细胞：指具备接受外源DNA能力的宿主细胞 （四）重组DNA导入受体细胞（菌） 导入方式 转化（transformation） 转染（transfection） 感染（infection） * * 第四节 DNA重组技术 DNA Recombination Technique 基因工程诞生的历史背景：  1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证明了DNA是遗传信息携带者。2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为cDNA的制备奠定了基础。 5. 染色体外DNA----质粒的深入研究，为第一批重组DNA载体提供了材料。 6. 1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化，为DNA的体外重组提供了有力的工具。7. 1972年，Berg.D等人首次用限制性内切酶EcoRI切割噬菌体和SV40病毒DNA分子，将这两种不同来源的DNA片段成功地在体外连接成杂合DNA分子。 至此，用重组DNA技术改变生物学性状的尝试在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技术为生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本身也迅速地发展起来，并广泛地渗透到各个学科的研究领域。 一、重组DNA技术相关概念 （一）DNA克隆 克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,即无性繁殖。 技术水平： 分子克隆（molecular clone） 即DNA克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 内切核酸酶 ，维持细菌遗传性状的稳定。 命名 　　限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别、结合的DNA位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。 识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、平头或钝性末端、配伍末端。 。 ５’ ５’ ３’ ３’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ (三)目的基因? 目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA