植物组织培养第十三章参考.pptVIP

第13章 植物离体低温保存 学习目的与要求 学习重点与难点 本章主要内容 1 超低温保存 2 低温保存 3 常温保存 第13章 植物离体低温保存 学习目的与要求 掌握植物离体低温保存的方法和程序。掌 握超低温保存的意义和基本原理。 第13章 植物离体低温保存 学习重点与难点 重点：超低温保存 难点：超低温保存原理 第13章 植物离体低温保存 指植物亲代通过生殖细胞或体细胞传递给后代的遗传物质。 为携带各种不同遗传物质的植物总称。 在适宜的环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。 将离体培养的植物细胞、组织、器官或试管苗，保存于人工环境下，一般是在低温或超低温条件下，抑制其生长，达到长期保存的目的。 第13章 植物离体低温保存 1 超低温冷冻保存技术 1.1 基本原理 将植物材料加入一定的冷冻防护剂，再经 一定的方法处理一段时间后，贮存在-80℃ 干冰温度)至-196℃ (液氮温度)的超低温条件 下，细胞内物质代谢及生命活动处于几乎完 全停止的状态，遗传变异也降到最低在适宜 的方法下使植物材料经冷冻和融化后仍能恢 复其活力，正常条件下重新生长发育 。 适合于长期保存。 第13章 植物离体低温保存 1 超低温冷冻保存技术 1.2 保存液 模拟细胞质的组成成分，配制各种保存液，以提供其生活环境及营养物质。保存液由以下几部分组成： ①电解质平衡盐溶液。 ②高渗溶液，如葡萄糖、甘露醇、蔗糖等常作为高渗剂。 ③营养液，如氨基酸、核苷类、葡萄糖等营养物。 第13章 植物离体低温保存1 超低温冷冻保存技术 1.3 保存的程序 （1）植物材料的选择 一般来说，细胞内游离水含量高或细胞为高度液泡化的成熟细胞，易受冷冻伤害而不易存活，相反细胞质浓厚的分生细胞则更易存活，所以若细胞处于旺盛的对数分裂期时，则抗冻能力强，易存活。常选择细胞培养物及植物茎尖、幼胚、幼苗等作为冷冻保存的材料。 第13章 植物离体低温保存1 超低温冷冻保存技术 1.3 保存的程序 （2）预处理 在冷冻之前对材料进行预处理，可改善细胞的 抗寒能力。 ①低温预处理：0℃左右处理数天至数周 ②在培养基中加人渗透剂，如甘露醇、山梨 醇、蔗糖、脯氨酸等，可提高材料的抗冻性。 ③在培养基中加入二甲基亚砜(DMSD)预培养24—48h，或用二甲基亚砜进行预冷处理，一般时间一般为20—60rain。 ④将培养细胞脱水到适当程度，可大大提高材 料冷冻及解冻后的存活率。 第13章 植物离体低温保存1 超低温冷冻保存技术 1.3 保存的程序 （3）冷冻防护剂 常用的冷冻防护剂分为2类，一类为渗透性冷冻防护剂，有二甲基亚砜、乙二醇酰胺、丙二醇、甘油等。另一类为非渗透性防护剂，有聚乙烯吡哆烷酮(PVP)、蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇等。 第13章 植物离体低温保存1 超低温冷冻保存技术 1.3 保存的程序 （4）冷冻 冷冻的方法一般有慢速冷冻法、快速冷冻法、逐步冷冻法、预冷冻法、干冻法、包埋脱水法、玻璃化法、利用驯化冰箱法。 （5） 贮存 在贮存期间，关键是要把冷冻温度持续维持在-196℃条件下，不发生温度的上下波动。 第13章 植物离体低温保存1 超低温冷冻保存技术 1.3 保存的程序 （6）解冻 解冻有2种方法，一是快速解冻法，即把液氮超低温冷冻的材料直接放入35—40 0℃的水浴中解冻，一般约需1-2min的时间；另一种方法是慢速解冻法，即在0℃、2－3 ℃或室温下进行解冻，这种方法易使细胞内重新形成冰晶，故应用较少。 第13章 植物离体低温保存1 超低温冷冻保存技术 1.3 保存的程序 （7） 植物细胞生活力的测定 ① 荧光素双醋酸酯法(FAD) 有荧光，有活力。 ② TTC法 染成红色，有活力；无色，无活力。 ③ 伊万斯兰染色法 不染色的细胞为活细胞。 第13章 植物离体低温保存1 超低温冷冻保存技术 1.3 保存的程序 （8） 再培养 解冻的材料，可以经过再培养获的再生植株。 在培养冷冻材料前，须对冷冻防护剂进行数次洗脱，一般用液体培养液进行清洗。 第13章 植物离体低温保存2 低温保存技术 2.1 保存的方法和原理 低温保存就是将种质用离体培养的方式贮存在非冻结程度的低温下