纸层析法首都医科大学公共卫生学院.pptVIP

毒理学基础 首都医科大学 营养与食品卫生学 首都医科大学 实验二蔬菜中胡罗卜素的测定 (纸层析法) 营养与食品卫生学学系 一、实验目的 通过本次实验掌握用纸层析法分析蔬菜中胡萝卜素的含量 。 二、原理 蔬菜的植物色素包括叶绿素、叶黄素及胡萝卜素等，它们能被丙酮、石油醚溶液提取出来。将样品提取液进行纸上层析，由于胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。 三、方法 （一）仪器： 组织捣碎机 层析缸：可用标本缸代替（内径10cm、高25cm） 分光光度计 恒温水浴锅 点样器或微量注射器 新华滤纸：定性，快速或中速，16cm×20cm （二）试剂 （1）石油醚(沸程30～60℃，分析纯)：同时是展开剂。 （2）丙酮：分析纯。 （3）丙酮－石油醚混合液：3∶7(V/V)。 （4）无水硫酸钠：分析纯。 （5）5%硫酸钠溶液。 （6）β－胡萝卜素标准溶液：取50mg β－胡萝卜素标准品，溶于数ml氯仿中，然后以石油醚稀释至100ml，其浓度约为500μg/ml，将此溶液稀释10倍，即得50μg/ml得胡萝卜素标准应用液。 （三）样品的采集和处理 （1）粮食：样品用水洗三次，置60℃烤箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。 （2）蔬菜与其他植物性食物：取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。 四、操作步骤 以下步骤需在避光条件下进行 （1）样品提取：　取适量样品，相当于原样1～5g(含胡萝卜素约20～80μg)的匀浆，置100ml带塞锥形瓶中，加入丙酮20ml，石油醚5ml，振摇1min，静置5min。 （2）在150ml分液漏斗中，放入5％硫酸钠溶液30ml。 （3）将锥形瓶内的提取液小心移入上述分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10ml丙酮－石油醚混合液（3：7），振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。如此反复提取2～3次，直至提取液无色为止。 （4）振摇分液漏斗，放置分层后，弃去下层水溶液。再用5%硫酸钠溶液15ml振摇洗涤，反复进行三次，直至下层水溶液清亮为止，目的是除尽丙酮，防止乳化。 四、操作步骤 （5）将石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠固体的小漏斗，滤入瓷蒸发皿。用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液合并瓷蒸发皿中。 （6）将瓷蒸发皿置于低温电热板上蒸发至约1ml时，取下，待其自然挥干。冷却后置于冰裕上，立即用石油醚2ml沿蒸发皿壁将色素洗下，混匀立即点样。 （7）层析 点样：准确吸取待检液40μl在滤纸下端基线上A、B两点之间或C、D两点之间迅速来回进行带状点样一次点完（见图1）。每个样品点2带作为平行样。 展开： 待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，用定书机固定两边，置于预先用石油醚饱和的层析缸中（见图2），进行上行展开。（注意纸纹方向与展开方向一致；缸内石油醚深度约1cm即可，样斑不能直接接触石油醚。 （8）洗脱：待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5ml石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。 （9）比色：用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下，测吸光度。 （10）标准曲线绘制：取浓度为50μg/ml的β－胡萝卜素应用液2ml放入100ml具塞锥形瓶中，以下操作步骤与样品1－9项相同，但点样体积分别为20μl、40μl、60μl、80μl和100μl，相当于含胡萝卜素1、2、3、4、5μg。比色后，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 五、计算 式中：X2——样品中胡萝卜素的含量，以β－胡萝卜素计，mg/100g；　　 c——在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量，μg；　　 V1——点样体积，ml；　　 V2——加入瓷蒸发皿内的样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，ml；　　 m——样品质量，g。 六、注意事项 样品捣碎时加水不能太多，否则不仅提取困难，还不容易得到均匀样品。 滤纸层析一结束，应立即从层析缸中取出，并尽快剪下胡萝卜层析带进行洗脱，以免氧化使结果偏低。 本方法适用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡萝卜素的测定，其最小检出限为0.11μg。 结果的允许差：同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值≤10%。 七、实验报告应包括以下内容 1．实验目的。 2．实验原理。 3．实验方法。 4．实验操作步骤。 5．结果的计算。 6．实验注意事项。 7．结果的评价和小结。 毒理学基础 首都医科大学 营养与食品卫