实验十一DNA的定量测定.doc

实验十一 DNA的定量测定-二苯胺法 一．目的 学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 二、原理 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成-羟基-a-酮基戊糖，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，可用比色法测定。 三、实验仪器 试管 移液管 7220分光光度计 四、实验试剂 1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。 2、二苯胺试剂： A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。 B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制 临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可 五、实验步骤 1.标准曲线的绘制 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂： 2.样品测定 吸取DNA样液2ml，加入二苯胺溶液4.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。 六．实验结果 解得DNA样液浓度为112.52ug/ml 七．实验分析 因为二苯胺稍溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯等，能溶于浓无机酸中，但用水稀释时又析出。故在实验后，如果继续往试管里加蒸馏水则会产生白色混浊，并且当蒸馏水加到一定量时，白色混浊又会消失 测定DNA浓度的方法有两种,即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值;另一种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量. 紫外光吸收法:因为组成核酸的碱基(G,A,T,C)在260nm处具有强吸收峰,所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量.但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同.因此,一般在中性pH值左右的环境中进行测定.这种方法常用于测定比较纯的样品.溴化乙锭荧光强度法:当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时,会影响紫外光吸收值的测定,这时,可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度,因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比. 注意事项 1、二苯胺法测定DNA含量灵敏度不高，待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。 2、样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯