2各种PCR技术 二PPT.ppt

TaqMan法优缺点 Real-time PCR 方法应用 ?绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 ?相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 绝对定量与相对定量的定义 绝对定量通过标准品定量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： ?含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ?含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ?PCR的产物 绝对定量：从荧光到拷贝数 相对定量通过内标定量 内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 相对定量：参照因子Calibrator  相对定量分析方法1 -ΔΔCt 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏 差在 5％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值： ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCT=表达量的比值 相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度 标准品 标准品梯度稀释方法 平台PCR仪介绍 ABI 7500 fast 特征： 使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观 ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动） Rn= Normalization = Reporter / Referenc PCR 技术 普通的PCR PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 2 PCR技术的特点 1 ）高度的灵敏性 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR产物每轮循环增加一倍 2 ）特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 高浓度引物 低浓度引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3）多重PCR（复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 在同一反应中用多组引物同时扩增几种 基因片段。如果基因的某一区段有缺失，则相应的电泳谱上这一区带就会消失 。复合 PCR主要用于同一病原体的分型及同时检 测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。 电泳 引物 1 2 3 4 1 2