志贺氏菌检测试剂盒双色实时荧光PCR法说明书.doc

miR-92a含量检测试剂盒（荧光RT-PCR法）说明书  【产品名称】 通用名称：miR-92a含量检测试剂盒（荧光RT-PCR法） 【包装规格】 48份/盒 【预期用途】 iR-92a来自人类13号染色体上的miR-17-92基因簇，是一类小分子非编码RNAPTEN、KLF4和下游的p21基因来促进大肠癌细胞的增殖和迁移，在大肠癌患者粪便样本中miR-92a含量增高，可作为大肠癌标志物。 本试剂盒用于人粪便样本中的miR-92a含量测定，对临床医师建议做肠镜检测，但因病人依从性差或其它医学原因无法做肠镜检测的患者进行大肠癌的辅助诊断，不能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据，不宜用于普通人群的肿瘤筛查，仅作为辅助诊断供临床医师参考。 【检验原理】 miR-92a含量检测试剂盒（荧光RT-PCR法）是采用RNA提取试剂盒提取粪便中的RNA，将提取的RNA稀释到6 ng/μL后进行RT-PCR反应，反应中的引物探针能够与miR-92a特异性结合并进行扩增，在扩增过程中探针与含miR-92a的模板链互补结合并释放荧光信号，被检测到的荧光信号可以反映起始miR-92a的含量，根据样本中miR-92a含量高低辅助判定受试者是否患大肠癌。 【主要组成成份】 成份 管数 装液量 miR-92a反转录反应液 1 185 μl miR-92a PCR反应液 1 800 μl miR-92a 反转录引物 1 25 μl miR-92aPCR引物、探针 1 85 μl miR-92a阳性质控品 1 20 μl miR-92a 阴性质控品 1 50 μl 反转录酶 1 33.5 μl RNA 酶抑制剂 1 6.5 μl Taq酶 1 15 μl 0.1%DEPC水 2 1200 μl 本产品配套使用的核酸提取试剂为深圳市晋百慧生物有限公司生产的核酸提取试剂，备案号为：粤深械。 注意：miR-92a阳性质控品需按检测方法中3.1说明进行稀释。 【储存条件及有效期】 试剂盒-20 ℃及以下冷冻运输。 试剂盒在-20 ℃及以下条件下保存有效期为12个月。 试剂盒使用时尽量避免反复冻融，冻融次数不得超过5次。 【适用仪器】 本试剂盒适用于ABI 7500、LightCycler 480实时荧光定量PCR仪。 本试剂盒要求仪器使用FAM通道采集扩增荧光信号。 【样本要求】 本试剂盒适用于粪便样本的核酸检测，样本应避免为水状粪便。 样本采集量：粪便样本约0.3～0.5 g；样本采集及保存时，应避免样本间交叉污染。 储存和运输：样本采集后若不能立即检测，可置于-80 ℃保存；并且低温运输。 样本在保存期间建议避免反复冻融。 样本RNA提取：本公司可提供RNA提取试剂盒。 【检验方法】 样本采集： 1.1 大便须排入一个干净的容器中，避免与水、尿液混合； 1.2 小心打开采样容器，用附在采样容器盖上的小匙来刮取适量粪便表面样本，去除明显食物残渣，避免样本粘附于容器外壁； 1.3样本采集后若不能立即检测，可置于-80 ℃保存，保存期为8个月。 1.4。 2RNA提取 2.1 取0.3-0.5 g的粪便样本到一新的2 mL离心管中； 2.2加入ml Buffer A，漩涡震荡min使样品，静置min； 2.3 13000 rpm，°C离心min后，吸取0.5ml上清液转移到另一新的离心管中； 2.4 加入ml Buffer B，震荡s混匀，室温静置min；然后加入0.2ml氯仿激烈振荡10s，静置10min； 2.5 13000 rpm ，4°C，离心10 min后；吸取上清液0.6ml至新的离心管中待用。 2.6 .在96孔板第一列孔中加入500μl无水乙醇、40μl Beads A及280μl 步骤1.5中的上清液（如果上清液不足，补加PBS至280μl ），并记录样本孔位。 2.7 .在96孔板第二和第三列孔中加入800μl Wash A，第四和第五列孔加入800μl Wash B，第六列孔加入120μl 0.1%DEPC水。 2.8将已准备好的96孔板放入核酸提取仪中，插入搅拌套架，关闭提取仪舱门，按照下表设置运行程序并保存，点击屏幕上“运行”按钮运行程序 运行程序表 步骤 孔位 运行类型 振荡时间 振荡暂停 分离时间 挥发时间 振荡 幅度 温度 1 1 萃取材料 30s 20s 30s 10s 4 off 2 2 漂洗蛋白 30s 20s 30s 10s 5 off 3 3 漂洗蛋白 30s 20s 30s 10s 5 off 4 4 去盐漂洗 30s 20s 30s 10s 5 off 5 5 去盐漂洗 30s 10s 10s 60s 5 off 6 6 洗脱R