CN107365784-CN201710652281-一种用于递送至中枢神经系统的融合蛋白及合成方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 107365784 A (43)申请公布日 2017.11.21 (21)申请号 201710652281.2 (22)申请日 2017.08.02 (71)申请人 滨州医学院 地址 264003 山东省烟台市莱山区观海路 346号 (72)发明人 程梅　吴玉龙　李波清　倪天辉　 张莹　周秀芝　 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人 汤东凤 (51)Int.Cl. C12N 15/63(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (54)发明名称 一种用于递送至中枢神经系统的融合蛋白 及合成方法 (57)摘要 本发明属于医疗领域，公开了一种用于递送 至中枢神经系统的融合蛋白及合成方法，所述合 成方法包括提取信息核糖核酸mRNA，并利用反转 录酶将mRNA合成互补脱氧核糖核酸cDNA，克隆 GDNF基因和BDNF基因，并将穿透肽PEP-1的编码 脱氧核苷酸分别融合到神经细胞营养因子GDNF 基因和BDNF基因的氨基酸末端N-端或C-端等，融 合蛋白为M-Y-N化合物。本发明治疗效果明显，纯 化的GDNF融合蛋白具有穿透肽和GDNF二者的功 能；克服大脑的血脑屏障，使GDNF能经外周血液 循环系统穿越血脑屏障进入脑组织，发挥其生物 A 活性，达到治疗相关神经系统疾病的目的。 4 8 7 5 6 3 7 0 1 N C CN 107365784 A 权　利　要　求　书 1/1页 1.一种用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法，其特征在于， 所述用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方法包括以下步骤： 提取信息核糖核酸mRNA，并利用反转录酶将mRNA合成互补脱氧核糖核酸cDNA，然后，应 用PCR技术，克隆GDNF基因和BDNF基因，并将穿透肽PEP-1的编码脱氧核苷酸分别融合到神 经细胞营养因子GDNF基因和BDNF基因的氨基酸末端N-端或C-端； 将GDNF融合基因和BDNF融合基因插入原核细胞表达载体，构建成GDNF融合基因表达质 粒和BDNF融合基因表达质粒； 将GDNF融合基因表达质粒和BDNF融合基因表达质粒转化感受态表达菌，形成含有GDNF 融合基因表达质粒的转化子和含有BDNF融合基因表达质粒的转化子； 在适当条件下培养转化子表达菌株，并用诱导剂诱导表达菌内的表达质粒GDNF融合基 因和表达质粒BDNF融合基因的转录、并合成融合蛋白。 2.如权利要求1所述的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白的合成方 法，其特征在于，合成融合蛋白后还需进行：通过蛋白质纯化技术、WesternBlot分析和细胞 分析确定融合蛋白的生物功能活性。 3.一种如权利要求1所述合成方法的用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋 白，其特征在于，所述用于将GDNF和BDNF递送至中枢神经系统的融合蛋白为M-Y-N化合物； 其中M是肽载体；N包括结构相同的多种多肽；Y是结合M与N的连接物； 所述多种多肽包括： GDNF，具有至少一种GDNF活性的片段； GDNF类似物； BDNF，具有至少一种BDNF活性的片段； BDNF类似物。 4.如权利要求3所述的用于将GDNF和BDNF递送至中