CN107043807-CN201710043920-一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 107043807 A (43)申请公布日 2017.08.15 (21)申请号 201710043920.5 (22)申请日 2017.01.19 (71)申请人 昆明医科大学 地址 650500 云南省昆明市呈贡区雨花街 道春融西路1168号 (72)发明人 宝福凯　柳爱华　陶律延　杨佳儒　 麻明彪　韩欣霖　彭芸　白若兰　 戴熙廷　赵华　沈龙强　 (74)专利代理机构 昆明今威专利商标代理有限 公司 53115 代理人 赛晓刚 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) 权利要求书2页 说明书6页 附图4页 (54)发明名称 一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率 的测定方法 (57)摘要 本发明公开了一种结核分枝杆菌感染人体 后细菌存活率的测定方法，所述测定方法收集结 核分枝杆菌感染后的细胞或组织，提取细胞/组 织内结核分枝杆菌的总DNA和总RNA，总RNA反转 录得到cDNA；用结核分枝杆菌的cDNA引物、人的 内参基因DNA引物分别对同一个体的cDNA及DNA 进行Real-time qPCR绝对定量，根据结核分枝杆 菌RNA的拷贝数/人内参基因DNA的拷贝数得到结 核分枝杆菌的存活率。本发明操作简单，测得结 果准确度高，实验误差小，通过细胞/组织内结核 分枝杆菌16sRNA水平表达量与人内参基因水平 A 的比值作为评估细菌生存能力的指标。此指标可 7 用于评价结核感染的严重程度及临床药物治疗 0 8 3 效果。 4 0 7 0 1 N C CN 107043807 A 权　利　要　求　书 1/2页 1.一种结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于，所述测定方法 包括以下步骤： 步骤(1)收集结核分枝杆菌感染后的细胞/组织，提取细胞/组织内结核分枝杆菌的总 DNA和总RNA； 步骤(2)将提取的总RNA进行反转录，得到总cDNA； 步骤(3)采用结核分枝杆菌的cDNA引物和人的内参基因DNA引物分别对同一个体的总 cDNA及总DNA进行Real-time qPCR绝对定量得到结核分枝杆菌cDNA拷贝数，人的内参基因 的DNA拷贝数； 步骤(4)根据结核分枝杆菌cDNA拷贝数/人的内参基因的DNA拷贝数得到结核分枝杆菌 的存活率。 2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于， 所述人的内参基因为β-actin或GAPDH。 3.如权利要求1所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于， 所述总cDNA采用Real-time qPCR绝对定量时以结核分枝杆菌16sRNA基因的RT-PCR产物作 为标准品；总DNA采用Real-time qPCR绝对定量时以人内参基因β-actin的PCR产物作为标 准品。 4.如权利要求1所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特征在于， 所述结核分枝杆菌感染后的检测样本来源于肺外结核病人病灶组织或血液。 5.如权利要求1～4任一所述的结核分枝杆菌感染人体后细菌存活率的测定方法，其特 征在于，所述Real-time qPCR绝对定量方法如下： 步骤(1)标准品的建立以结核分枝杆菌16sRNA基因的RT-PCR产物作为标准品，所述标 准品碱基数已知，使用微量核酸蛋白测定仪检测标准品的cDNA浓度；以人的内参基因β-