大学本科生物化学实验理论.doc

细胞破碎常用方法 方法 技术 原理 效果 成本 机械法 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 组织捣碎法 细胞被捣碎机捣碎 适中 适中 匀浆法 须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎 剧烈 适中 超声波法 用超声波的空穴作用使细胞破碎 适中 昂贵 酶法 外加酶或自溶法 细胞壁被消化，使细胞破碎 温和 昂贵 化学法 有机溶剂法 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳 适中 便宜 表面活性剂法 表面活性剂溶解细胞壁 温和 适中 物理法 渗透冲击 渗透压破坏细胞 温和 便宜 反复冻融法 15℃至-20℃冷冻，再室温下融化，膜的疏水键被破碎 温和 撞击破碎 干燥法 体细胞失水 剧烈 温度差破碎法 层析技术方法简介 阳离子交换剂交换原理： RC-C1++C2+ RC-C2++C1+ ㈢离子交换层析过程中的关键技术 1、交换剂处理 ①漂洗 目的是除去杂质用倾倒法除去细小颗粒（这一步一定要到做位。留下细小颗粒会堵塞层析柱下的尼龙网眼。）直至水清澈无色。 ②处理 用酸碱轮换浸泡，以便使交换剂带上需要的平衡离子。 ③平衡 经处理后，要用大量的水悬浮交换剂，最后用缓冲液平衡 2、柱的选择与装柱 装填均匀，松紧一致，没有气泡，没有裂缝。 3、上样要求 加入样品液的体积一般应小于床体积的1/3。 4、洗脱剂 原则四条：①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。④要确定一定的离子强度。 5、洗脱速度 洗脱速率太快和太慢都会降低分辨率。 (1)天然凝胶：琼脂糖凝胶 (2)人工合成凝胶: 葡聚糖凝胶（其商品名称Sephadex），G-25，G-75，G-100 ，G-等型号的凝胶。其中G后面的数据为得水值，即每g干胶吸水毫升再乘以10. G-25脱盐。 3、 应用：(1)分离、纯化与鉴定； (2)测定相对分子质量； 三 亲和层析 1、原理：利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。 2、应用： 酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受体。 四 吸附层析 1、原理：利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离溶剂中的溶解度差异进行分离，取决于物质的分子结构。 2、分类： (1)物理吸附，如：活性炭； (2)化学吸附，如：氧化铝； (3)交换吸附，如：硅胶。 电泳原理与技术 目前常用的电泳系统为区带电泳。 任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道，常见凝胶电泳的支持介质有（1）聚丙烯酰胺凝胶（2）琼脂糖凝胶（3）淀粉凝胶。 一 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）PAGE技术流程简介 1.组架（玻板、胶条、U型玻板、封胶）2.制胶（分离胶溶液、浓缩胶溶液、插入梳子）3.点样4.电泳 5.染色6.脱色7.分析 （二）丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构 1、聚合原理：聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是用丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙烯在催化剂的作用下聚合而成。通常采用过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以N,N,N’,N’-四甲基乙二胺为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。聚合好的凝胶是立体网状结构。 2、凝胶浓度和蛋白质分子量的关系 凝胶中网眼的大小与胶的浓度有关，凝胶的浓度越小，其网眼越大，胶的浓度越大网眼越小。分离分析较小的蛋白质分子时用较高浓度的凝胶，而分离分析分子量较大的蛋白质时则用较大浓度的凝胶。 （三）影响凝胶聚合速度主要因素 1、引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。 2、系统pH值 酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。 3、温度 低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性； 4、分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。 5、系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合； （四）PAGE分离蛋白质原理 PAG系统电泳分离蛋白质具有很高的分辨率，因为该系统工作状态下存在三种效应。 1浓缩效应 指样品在进入分离胶之前被浓缩成一条细线的现象。（1）在电泳系统中有含甘氨酸的Tris-HCl(pH8.5)电极缓冲液，浓缩胶pH6.5，通电后样品中的各种带负电荷的蛋白质会在快离子(Cl-)和慢离子(0.1%Gly-)形成的高压带之间初步分开并形成很窄的条带，而使整个样品中的蛋白质在将进入分离胶时会形成一条细线，即被浓