生物制药工艺技术基础（全套课件239p） ppt课件.pptVIP

其原理是，在PCR反应过程中热稳定聚合酶（即Taq聚合酶）可以向PCR产物的3′末端加上一个不依赖于模板的腺苷酸（A）。利用这个末端突出的3′A，即可将PCR产物直接插入到插入位点只有一个3′T突出的线性T载体分子。这种方法只限于PCR产物的克隆，且必须采用3′T突出的T－载体。? 3、DNA重组体导入宿主细胞技术 （1）DNA重组体导入微生物细胞的方法 ①转化作用。转化是指微生物细胞直接吸收外源DNA的过程，而通过转化接受了外源DNA的细胞称为转化子。 在分子克隆中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA分子的敏感细胞才能用于转化，此时的细胞称为感受态细胞。 将细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球型（感受态），经42℃短时间热冲击后，细胞可吸收外源DNA，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原，并分裂增殖。 除化学法转化细菌外，还可采用高压脉冲电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细胞。 ② 转导作用。λ噬菌体载体所构建的重组DNA分子可以直接感染进入E.coli寄主细胞内，这叫转染，但转移效率很低。 为了提高转移效率，重组的λ噬菌体DNA或重组的黏粒DNA必须包装成完整的噬菌体颗粒，通过温和噬菌体颗粒的释放和感染将重组DNA转移至宿主内，这称为转导，而通过转导接受外源DNA的细胞则称为转导子。 （2）DNA重组体导入动植物细胞的方法 随着高等动植物细胞基因工程的发展，人们发明了多种基因转移技术，根据原理不同，主要可分为物理方法、化学方法和生物学方法3大类，见表2－ 6。 4、筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆 为了提高筛选效率，建立好的筛选模型十分重要。因此，在进行基因克隆实验设计时首先必须考虑重组子的筛选方案，根据目的基因的特性，选择合适的载体与宿主细胞。 （1）根据遗传表型差异进行筛选 由于外源基因的插入使得载体分子上的一些筛选标记基因的失活，从而导致宿主细胞的某些遗传表型的改变，便可直接筛选出重组子菌落。 ①抗药性筛选。在含有两个抗药性基因的载体中，插入失活其中一个基因，再用两个不同抗性平板对照筛选出重组子。 ②β－半乳糖酶显色反应选择。 ③噬菌斑形成能力 没有外源DNA插入的载体不能包装成噬菌体颗粒，不能感染细菌形成噬菌体。 （2）根据重组子的结构特征进行筛选 ① 快速裂解菌落比较重组DNA分子大小。直接进行凝胶电泳。 ② 限制性内切酶分析。即快速提取质粒DNA，用限制性内切酶进行双酶切，将酶切产物进行凝胶电泳分析，与分子质量标准作对照，根据片段的大小和酶谱特征判断是否为阳性克隆。 ③ 原位杂交。原位杂交是以基因探针检出培养板上阳性重组子菌落位置的技术。是从基因文库筛选阳性克隆的首选方法。 ④ PCR筛选法。 根据目的基因两端已知核苷酸序列设计合成一对引物，依据实验目的与要求的不同快速抽提宿主细胞质粒DNA或染色体DNA作为模板进行PCR扩增反应，将扩增反应物进行凝胶电泳分析，若出现特异片段的扩增条带，即说明该克隆为阳性克隆。 该法快速、灵敏、简单、易行，广泛应用于阳性重组子的筛选。 5、基因表达系统 基因工程的最终目的是在合适的宿主系统中使目的基因获得高效表达，从而生产出有重要价值的目的蛋白质或多肽。 （1）大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统虽然不能像真核系统那样进行翻译后加工（尤其不能进行糖基化），因此像EPO等需要糖基化才有活性的目的蛋白不能在该体系进行表达。但它具有遗传背景比较清楚，使用安全、技术操作简便，繁殖力强（平均20～30min即可繁殖一代），便于大规模培养，成本较低，表达水平较高，下游技术成熟、易于控制。是目前使用最广泛、最成功的表达系统。 ①启动子和终止子。启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并启动mRNA合成的长40～50bp序列。原核生物启动子包括两个高度保守区域，一是Pribnow box，位于起始位点上游5～10bp，由6～8bp组成，富含A、T，故又称为TATA box或－10区，来源不同的启动子，Pribnow box的碱基序列稍有变化； 另一个是－35区，位于转录起始位点上游约35bp处，一般由10bp组成。－35区提供了RNA聚合酶识别信号。 5′—ITGACA—TATAAT—／／－3′ 启动子有强弱之分，强启动子与RNA聚合酶结合紧密，可使基因获得高水平转录，弱启动子则相反。 原核启动子聚合酶不能识别真核细胞启动子，因此只有将真核