第六章离心技术概要.ppt

原理 差速区带离心法是离心前在离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处的介质密度最小，离旋转轴最远处介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒于的最小密度。这种方法是根据分离的粒子其在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。 原理 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液面或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时速度为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。 ρm＞ρP时粒子上浮；ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm； 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 收集区带的方法： （1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。 （2）用针刺穿离心管底部滴出。 （3）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。 3、 区带转头 （zonal rotor） 区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转子四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。 优点： 因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率； 缺点： 样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。 4、垂直转头（vertical tube rotor） 样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。 5、连续流动转头 （continuous flow rotor） 用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。 三、离心机转头的性能及主要参数 （一）转头的性能 材料：一方面坚固耐用，另一方面质量轻容易提速； 1、铝合金转头 特点： A、铝为两性金属，适用于近中性溶液离心，洗涤也考虑酸碱度； B、强度不高，但易加工； C、高浓度盐影响转头强度； D、高温使强度降低，不能灭菌； E、价格便宜，使用寿命短； 2、不锈钢转头 特点： A、耐腐蚀； B、强度高，加工难； C、质量大，离心速度不高； D、寿命长，价格便宜； 3、钛合金转头 特点： A、耐腐蚀； B、强度高，加工难； C、质量不很大，离心速度高； D、寿命长，价格较贵； 4、碳素转头 特点： A、质量轻，利于提速； B、耐腐蚀； C、机械强度高，加工容易； D、使用寿命长，价格昂贵； （二）转头的主要参数 1、最大转速 过速保护装置 2、最大离心力 3、最大容量 容量越大，转头越大，转速越低； 四、离心管的性能及选择 （一）玻璃离心管绝对不能在高、超速离心机上使用。 （二）塑料 1、PE（聚乙烯）管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。 2、PP（聚丙烯）管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消