细胞破碎技术概要.ppt

细胞破碎技术 孙万儒 中国科学院微生物研究所 前 言 破碎细胞的方法和技术 细胞壁的组成和结构 细菌细胞壁的组成 细菌细胞壁的组成 细菌细胞壁的组成 细菌细胞壁的组成 酵母细胞壁 酵母细胞壁 酵母细胞壁 真菌细胞壁 细胞壁组分与真菌分类 真菌细胞壁 真菌细胞壁 细胞壁结构与破碎 细胞壁结构与破碎 破碎分析 1. 直接测定法 2. 间接测定法 (1)稀释法 (1)稀释法 (2)质量平衡法 (2)质量平衡法 (3)电导测定法 原 理 应用 设备和原理 设备和原理 应用与局限 应用与局限 应用与局限 大规模应用的对策 设备与机理 设备与机理 设备与机理 影响破碎的因素 影响破碎的因素 影响破碎的因素 影响破碎的因素 影响破碎的因素 影响破碎的因素 设备与机理 设备与机理 设备与机理 技术适用性 影响破碎的因素 影响破碎的因素 大量破碎微生物细胞的方法 球磨破碎技术 设备及原理 设备及原理 设备及原理 设备及原理 设备及原理 设备及原理 设备及原理 细胞破碎原理及动力学 细胞破碎原理及动力学 影响细胞破碎的因素及其相互关系 影响细胞破碎的因素及其相互关系 细胞浓度 细胞浓度 细胞浓度 细胞浓度 细胞浓度 球磨剂 球磨剂 球磨剂 球磨剂 球磨剂 球磨剂 搅动速度 搅动速度 搅动速度 叶轮结构 叶轮结构 叶轮结构 叶轮结构 叶轮结构 叶轮结构 流速 流速 流速 时间 温度 几个典型实例 几个典型实例 几个典型实例 几个典型实例 原理 操作 有机溶剂法 表面活性剂法 表面活性剂法 变性剂法 螯合剂法 碱处理法 酶处理法 酶处理法 酶处理法 应用与发展 应用与发展 应用与发展 应用与发展 应用与发展 各种细胞破碎方法的比较 各种细胞破碎方法的比较 细胞破碎技术的发展 由上游解决的技术 由上游解决的技术 由上游解决的技术 由上游解决的技术 由上游解决的技术 与下游技术结合 谢谢！ 研磨法 最早在实验室用的研磨法是使用氧化铝，也可用细玻璃粉或石英粉作为研磨剂， 其颗粒大小为0.1 nm。先将细胞和研磨剂按1比5的比例混合均匀，预冷后放入研钵，手持研磨杵进行研磨。依靠在压力下推动固体与细胞的挤压与磨擦使细胞壁破碎。该法简便，但效率低，处理量小。只能在实验室中使用。根据这个原理,设计了细菌磨。 细菌磨结构示意图 主要由研磨和动力两部分构成。研磨部分包括滚筒和承座。滚筒是长15 cm，直径5 cm，厚度为2 nm以上的硬质磨砂玻璃管；承座是能与玻璃滚筒的半面密切贴合的凹型硬质瓷座。玻璃滚筒两端用橡皮塞密封，一端带有被动轮的钢轴通过橡皮塞中心贯穿玻璃滚筒，滚筒与瓷承座不但要密切吻合，且必须互相贴紧。因此，在瓷承座下必须垫以强有力的弹簧或富有弹性的橡胶。玻璃滚筒内可加入冰块，以便降温；瓷承坐也可制成中空的，接上进出口，可以通入冷却水，以便控制研磨细胞时的温度。 动力部分是一小马达，由皮带与被动轮传动，减速后，滚筒转速为120-130 r/min。 将湿菌体与1.3-1.5倍重量的直径在3mm以下的玻璃粉研磨剂共置一研钵内，冷却至5℃以下，迅速将玻璃粉和湿细胞混合均匀，研压成块，用不锈钢勺取5 g左右的混合物，自旋转的滚筒前边加入并迅速挤压，使混合物随滚筒进入磨中，随即压挤附着在滚筒表面形成薄层，研磨20-30 sec，用一长方形玻璃片横置于滚筒面上，将研磨的混合物自滚筒上刮下。 研磨混合物中的水量极为重要，太少时混合物不能附着在滚筒上，太多时研磨破碎效率大幅度降低。因此，研磨混合物制备时的水量应根据细胞的干湿加以控制。破碎率可通过破碎时间加以掌握，一般也可达到95%以上的破碎率。 利用该法破碎细胞的效率低，它只适于实验室和小量制备。但其适用范围较广，可破碎细菌，酵母，真菌，甚至动植物组织。 干燥提取法 该法适合提取酵母中比较稳定的酶。通过干燥使细胞膜的渗透性改变，从而使细胞内某些物质容易抽提。 干燥的方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和水溶性有机溶剂脱水干燥等。空气干燥一般是在25-30℃或高至35-40℃的干燥气流中吹干，将干细胞再悬浮在3-5倍的水或缓冲液中，室温下搅拌2-3 h抽提。抽提的缓冲液pH在8-9时比7.0时抽提的可溶性蛋白质较多；如果目的蛋白质稳定性较高，可在40-45℃下抽提；如果目的蛋白质不稳定，需在较低的温度下处理。一般来说， 空气干燥的细胞提取的蛋白质要比真空干燥和冷冻干燥的多，这是由于在空气干燥时细胞会发生自溶的原故。 在有机溶剂脱水干燥时使用的