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倒置荧光显微镜 生物实验导论-- 荧光显微镜 科学实验中心三部 张四洋 正置荧光显微镜 成像基础：荧光 荧光- 3个过程 荧光特征 吸收能 ：基态分子 （能量最低）吸  激发光谱：在不同波长光的激发下，发光物质某一 收某种特定频率的电磁波 （光子） 发光谱线的强度或发光效率与激发光波长的关系。 后获取能 →吸收能 跃迁：分子中的电子跃迁到较高能级 的电子轨道而使分子处于电子激发 态，约10-15s 释放能 ：激发态的分子发射出相应 能量的光子回到基态→释放能 。  发射光谱：发光物质在某一波长激发光的激发下， 其不同波长的发光强度的强弱变化。 1 斯托克司 （Stokes）位移：最大荧光发射 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光 波长与最大吸收波长之差。 子产率、消光系数以及含量等因素有关。 荧光量子产率：量子产率表示物质将吸收 的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发 出光子数与吸收光子数的比值。 荧光光谱特征 （1）：激发光谱和发射光谱 荧光寿命：当一束光激发荧光物质时， 根据激发光谱选择激发波长：能够激发荧光物 荧光物质的分子吸收能量后从基态跃迁 质发光的最大辐射时的特定波长 到某一激发态，再以辐射的形式发出荧 常用荧光素的激发波长： 光回到基态，激发停止时，分子的荧光 DAPI: 372nm ， 强度降低到激发时最大强度的1/e时所需 Hoechest 33258、33342 ：365nm、355nm FITC 、Acridine Orange：490nm 的时间为荧光寿命。 Acridine Yellow ：470nm 根据发射光谱确定发射波长 （选择滤光片）： 荧光物质发光的最大辐射时的特定波长 荧光光谱特征 （2 ）：具有能  高能激发、低能释放；吸收短波、发射长波  激发荧光物体发光的最有效波长是紫外区 (200nm400nm)  激发波长发射波长，两者的差值：STOKES位移 2 提示– 完成良好的荧光检测 荧光现象 选择相应的激发波长 选择足够强度的激发光源 一次荧光现象：固有或自发荧光，一经辐射就