Nature Methods：一种全新的邻近蛋白质生物素化标记方法—可直接用于原代组织.pdfVIP

Nature Methods：一种全新的邻近蛋白质生 物素化标记方法—可直接用于原代组织 原创2017-12-20 订阅号APExBIO 研究意义 在生物学研究中，获取某一细胞系的蛋白质相互作用图谱或许并不难，但是直接从 原代组织中检测蛋白质组图谱甚至它们之间的相互作用是一个重大的挑战。近日， 来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)的研究团队设计了 一种新的生物素标记方法，用抗体代替传统的酶融合，标记靶蛋白邻近的蛋白。即 使用针对靶蛋白的抗体来引导生物素沉积到与其相邻的蛋白质上，通过链霉亲和素 磁珠捕获这些蛋白质并用质谱鉴定，样本可以是细胞或原代组织。该团队使用这种 方法检测了多种细胞和组织类型中靶蛋白即核纤层蛋白A 的邻近蛋白组成。 有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分都是与分子伴侣或者其它 蛋白质组装在一起发挥作用。蛋白质组装（Protein assemblies）对于所有活细 胞的功能都至关重要。细胞或组织中完整的蛋白质-蛋白质相互作用网络称为蛋白 质相互作用组（protein interactome），是动态的，会随着时间、发展阶段、 细胞周期进程或组织类型而改变。因此，表征蛋白质之间的相互作用可以获得靶 蛋白质的位置和功能等重要信息。然而，特定突变对组织特异性蛋白质相互作用 组的影响很少被详细研究。 我们都知道单个基因的不同突变可能会导致不同的疾病。如核纤层蛋白 A / C （LMNA）基因有400 多个不同的突变，会产生超过14 种不同的表型，这些表型引 起不同病症包括脂肪营养不良、肌营养不良和早衰综合症。然而这些单基因突变 与其高度可变表型之间的机制联系尚不清楚。尤其是组织特异性核纤层蛋白 （lamin）的相互作用组也有待阐明。 通过标准的免疫共沉淀（CoIP）分析核纤层蛋白的相互作用组是不切实际的，因 为由核纤层蛋白长丝产生的不溶性高阶结构导致无关蛋白的过量沉淀。已经用各 种遗传和生物化学方法来鉴定核纤层蛋白A 的相互作用蛋白，如利用生物素化的 邻近标记方法、表达高亲和力的 OneSTrEP-标签和免疫共沉淀、蛋白芯片等。虽 然这些方法鉴定了多个已知和新型的相互作用蛋白，但它们的应用仅限于单细胞 系。而且之前基于生物素化的邻近标记方法还需要在细胞系或种系中预先插入融 合基因，因此它们不能用于原代人组织样本。为了克服这些限制，作者开发了一 种抗体引导的，基于邻近的标记方法，称为抗体识别生物素化（BAR，Biotinylation by antibody-recognition），可以标记和分离靶蛋白附近的蛋白。 什么是抗体识别生物素化（BAR）方法？ 图1 抗体识别生物素化（BAR）方法。细胞或原代组织样品被固定并透化。一抗结合感兴趣的靶蛋白， 带有HRP 的二抗结合一抗。在生物素-酪胺偶联物（biotin-tyramide）和过氧化氢的孵育下，HRP 催化 生物素偶联物产生自由基，附着在与靶蛋白相邻的蛋白质上并使其生物素化。通过与生物素具有高亲和 力的链霉亲和素磁珠分离蛋白质，用western 印迹和质谱进行分析。 BAR 法用于鉴定靶抗原附近的蛋白质（图 1）。在固定的和透化的组织样品中， 使用一抗来靶向感兴趣的蛋白质。在过氧化氢和生物素-酪胺（biotin-tyramide） 的存在下，HRP （辣根过氧化物酶）缀合的二抗产生自由基，其导致靶蛋白质的 相邻蛋白质发生生物素化。使用链霉亲和素（Streptavidin）包被的磁珠来沉淀 生物素化的蛋白质，然后通过串联质谱法检测。 作者将该方法应用于线粒体验证了灵敏度和特异性，并成功地利用此方法表征多 种细胞系和组织中的核膜（nuclear envelope，NE）组成。 核纤层蛋白是核膜（NE）的重要结构元件。如（图2）所示，作者应用BAR 鉴定 了Hela 细胞中核纤层蛋白A / C 附近的蛋白质。从超分辨率显微镜可见，生物素 成功沉积在核膜（NE）上。 图2 超分辨率显微镜显示NE 上的生物素沉积（核纤层蛋白A / C 抗体;左）（FITC-抗生物素蛋白;右）。 细胞培养虽然可以模仿整个生物体内发生的相关过程，但在许多情况下并非是有 效的。为了克服这些局限性，作者试图在与核纤层蛋白病相关的原发性人体组织 中鉴定核纤层蛋白A / C 的相互作用蛋白。作者成功地在死后组织标本中标记了 NE。如（图3a），肌肉肌原纤维在细胞核中形成凹槽，这不仅与核纤层蛋白A / C 的分布相关，而且与DNA 相关。脂肪样品中的一些细胞