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生物小分子芯片 ——蛋白质芯片 一：蛋白质芯片？ 蛋白质芯片是指将蛋白质或多肽固定于支持介质表面，用于样品成分和蛋白质之间相互作用的分析，也叫做蛋白质微阵列 二：蛋白质芯片支持介质 聚丙烯酰胺胶；聚偏二氟乙烯膜；硝酸纤维素膜，载玻片；硅片；纸；PDMS（聚二甲基硅氧烷）；金。 聚丙烯酰胺胶配方： 3%的丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=3:1）、40%甘油、0.0002%亚甲基蓝、0.012%TEMED（四甲基乙二胺） 三：作为支持介质的条件 （1）与蛋白质能发生物理或化学上的反应 （2）要最大限度的保持蛋白质的活性 （3）不能或几乎不与被检测物发生相互作用 （4）化学性质相对不活泼 四：蛋白质芯片探针 抗原-抗体；酶与底物；mRNA-蛋白质 凡是能两两互补配对的都可以将其中一种固定于支持介质上 五：蛋白质固定的原理及技术 原理：物理吸附、离子吸附、共价结合 方法：接触点制；喷墨点制；无掩膜光刻技术；喷墨合成；基于掩膜的光刻技术；微珠芯片；电化学芯片 六：不同固定方法的优缺点 物理吸附不牢固但是对蛋白质的活性影响最小 离子吸附较物理吸附要牢固，对蛋白质的活性影响较共价结合小 共价结合最牢固，但是对蛋白质的活性影响最大甚至会导致蛋白质失活 七：蛋白质芯片分析技术 （1）：荧光/同位素检测技术 （2）：原子力显微技术 （3）：表面等离子体共振技术 （4）：多光子检测技术 （5）：表面增强激光解吸附/离子化技术 （6）：基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术 八：不同分析方法的对比 荧光同位素检测技术：操作简单；标记困难。 原子力显微技术：检测灵敏；样品用量少；无需标记；检测速度慢；价格昂贵。 表面等离子共振技术：灵敏度高；样品用量少；无需标记；成本较低；检测范围有限。 基体辅助激光解析电离飞行时间质谱技术：灵敏度高；检测速度快；难找到合适的光敏感化学物；要求较高纯度的蛋白质；无法进行定量检测 九：蛋白质芯片的应用 1：医学研究与临床诊断 2：药物筛选、测试与新药开发 3：食品卫生安全检测 Development and application of a fluorescence protein microarray for detecting serum alpha-fetoprotein in patients with hepatocellular carcinoma Journal of International Medical Research 2016, Vol. 44(6) 1414–1423 Microarray preparation 乙醛修饰载玻片→甲胎蛋白固定于载玻片（24h;4℃)→ 玻片浸泡在200ul blocking 缓冲液中（2h;37℃)→PBS 缓冲液冲洗4次，每次2秒，室温→室温晾干，4℃储藏。 AFP quantification 利用兔子获得甲胎蛋白的多克隆抗体，标记上生物素→与玻片反应（30min;37℃）→PBS缓冲液冲洗两次（室温；5s）→荧光标记链霉亲和素试剂反应（30min;37℃)→PBS冲洗四次（室温；5s) 血清样品→与玻片反应（30min;37℃）→PBS冲洗四次（室温；5s) ELISA 50ul AFP蛋白和样品添加到试剂盒反应2h;37℃→ 200ul洗脱液洗脱5次→添加50ul生物素标记的甲胎蛋白抗体（1h,37℃)→添加50ul SP conjugate（30min；37℃）→添加50ul染料（10min；37℃）→50ul反应停止液→450nm的条件下测定吸光度。 Result 80 ng/ml, 40 ng/ml, 20 ng/ml,10 ng/ml,5 ng/ml, 2.5 ng/ml,1.25 ng/ml,0.0625ng/ml,0.03125 ng/ml 甲胎蛋白浓度： HCC 对照组 assay AFP20ng/mL AFP20ng/mL AFP20ng/mL AFP20ng/mL 荧光蛋白芯片 38 27 0 45 ELISA 36 29 0 45 ELISA 荧光蛋白 + - total + 33 5 38 - 3 69 72 total 36 74 110 assay 检测时间h 血清体积ul 费用￥ 抗体体积nl 荧光蛋白 1.5-2 15 1.5 9-12 ELISA 3 50 5-10 100000