T7RNA聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定.pdfVIP

·272 · 安徽医科大学学报 　A cta Un ivers ita tis M ed icina lis A nhu i　2007 Jun; 42 ( 3) T7 RNA 聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定 虞结梅 ,杨 　兵 ,谢 　灿 ,陆燕燕 ,何金生 ( 摘要 　目的 　构建含 T7 RNA 聚合酶 T7 RNA Polym erase, ( + ) / T7 RN P,并观察 T7 RN P 在真核细胞 内表达 ) T7 RN P 的真核表达载体 , 同时构建含 T7 启动子 、增强型绿 及其与 T7 启动子和 TER 相互作用所介导的转录功 ( ) 色荧光蛋 白 Enhanced Green F luore scen t Protein, EGFP 和 能 。从而为进一步构建负链 RNA 病毒载体并开展 T7 RN P转录终止信号的载体 , 并通过观察 EGFP 的表达推 反向遗传学研究奠定基础 。 测 T7 RN P表达和 T7表达系统介导基因转录的功能 。方法 　根据编码 T7 RN P 的基因序列 ,应用 PCR 技术从含有 T7 1　材料与方法 RN P基因的 E. coli BL2 1 (D E3 ) 基因组中扩增编码 T7 RN P δ ( ) δ 1. 1　材料 　质粒 p x8 t为德国 M un ich 大学的 Con 的基因片段 ,克隆至载体 p cDNA 31 + 。同时从 p x8 t载 体和 p GEM T easy / EGFP 上切下 T7 RN P 识别的终止信号 zelm ann 教 授 馈 赠 , E. coli BL2 1 ( D E3 ) 、E. coli. α ( ) ( ) ( term inator, TER ) 和编码 EGFP 的基 因 , 克隆至载体 p cD DH 5 、p cDNA 31 + 、p cDNA II、p GEM 3zf + 、 NA II。将获得的两个重组质粒共转染 BHK细胞 。48 h 后 , p GEM 5zf ( + )及含有 EGFP 的 p GEM T/ EGFP和小 通过观察 EGFP 基 因在真核细胞 内的表达情况 , 推测 T7 仓鼠肾细胞株 BHK 细胞系为本实验室保存 , T4 RN P基因的表达及表达后识别 T7 启动子介导基因转录功 DNA 连接酶 、质粒提取及纯化试剂盒 、PCR 片段回 能 。结果 　成功构建了含 T7 RN P 编码基因的真核表达载 收及纯化试剂盒 、PCR M arker、Taq DNA 聚合酶 、Pfu 体 p cDNA 31 ( + ) / T7 RN P 和原核表达载体 p cDNA II/ EG DNA 聚合酶均购 自上海 Prom ega 公司 ; dN TP、脂质 FP / TER ,共转染 BHK细胞后 ,可观察到 EGFP表达的绿色荧 体转染试剂盒 L ipofectam ine 2 000购 自 Invitrogen 公 光 。结论 　T7 RN P 能顺利在真核细胞内表达 ,并通过与 T7 司 , IPTG及 X gal购 自华美物工程公司 ; 蛋白酶 K、 启动子和 TER 的相互作用 ,成功实