固始鸡与安卡鸡F2资源群Myf5基因PCR-SSCP分析条件的优化.pdfVIP

第 31卷 第 1期 家畜生态学报 Vo1．31No．1 2010年 1月 ActaEcologiaeAnimalisDomastici Jan．2010 固始鸡与安卡鸡 F2资源群 Myf5基因 PCR—SSCP分析条件的优化 黄 煌 ，马新红 ，康相涛 ，韩瑞丽 ，孙桂 荣 ，亢娟娟 ，刘 凯 (1．河南农业大学牧医工程学院．河南 郑州 450002；2．河南省家禽种质资源创新工程研究中心，河南 郑州 450002) [摘 要] 为进行固始鸡与安卡鸡 F 资源群Myf5基因的多态性研究，建立适合于该资源群 的Myf5基因PCR—SSCP分析方法，对影响单链构象多态性 (SSCP)图谱分辨率的凝、胶浓度、 甘油浓度、电泳电压 、电泳温度、电泳时间、PCR产物与上样缓冲液的比例 、电泳缓冲液浓度、 上样量等影响因素进行 了比较 系统的优化试验研 究。结果表 明：凝胶浓度 10 、甘油浓度 5O％ 、上样量 10肚L、PCR产物与变性缓冲液比例为 1O：10、电泳缓 冲液为 1×TBE、室温下 300V预电泳 i0rain后 120V 电压电泳 16h，染色后条带细而清晰，能够准确分辨各基因型， 为试验 SSCP分析的最佳条件组合。 [关键词] 固始鸡与安卡鸡F2资源群；Myf5基因；PCR—SSCP；正交试验 ；分析条件优化 [中圈分类号] $811．5 [文献标识码] A [文章编号] 1004—5228(2010)01—0034—04 PCR-SSCP是一种快速、简便 、灵敏的检测基因 鸡和安卡鸡 F 代资源群，12周龄 时颈静脉采血 ， 突变的方法，用于检测基因点突变、基因多态性分 EDTA抗凝 ，一80℃冰箱保存 。 析、病毒的分型、DNA定量分析、监测引起人类遗传 1．1．2 主要仪器设备 PCR扩增仪 、稳压稳流 电 性疾病的研究 、监测 PCR诊断实验中的交叉污染情 泳仪 、垂直板 电泳槽、一20℃冰箱 、台式高速离心 况以及识别未知基因等方面，其在分子生物学领域 机、鼓风干燥箱 、电泳仪电源 、凝胶成像系统、高压灭 发挥着巨大的作用。 菌锅、微量移液枪等。 在 SSCP标 记 分 析 中，PCR—SSCP分 析 包 括 1．1．3 试剂 Taq酶 (购 自东盛生物工程有限公 PCR扩增和单链产物凝胶 电泳两个阶段L1]。PCR 司)、蛋白酶 K、饱和酚 (pH 为 7．9)、氯仿 、异戊醇 、 扩增成功是 PCR—SSCP分析的前提条件，适宜 的凝 丙烯酰胺 (Acr，进 口分装)、N，N一亚甲基双丙烯酰 胶电泳条件是 PCR-SSCP分析有效检测基 因变异 胺 (Bis，进 口分装)、过硫酸铵、TEMED、GOLD- 的关键，但影响PCR-SSCP分析的因素较多，目前 VIEw、APS、Tris、乙醇、甲醛、冰醋酸 、硝酸 、ED- 尚没有一种 SSCP分析方法适合于所有的生物基因 TA、NaOH、AgNO 、碳酸钠等，以上试剂均为分析 样品分析 。为寻求更好 、更准确 的F。资源群 Myf5 纯或生化纯。 等位基因SSCP分析方法，本试验对有关影 响因素 1．2 方法 进行 了较分析，旨在从 中筛选 出一种比较理想的试 1．2．1 DNA提取 利用一80℃保存的固始鸡和 验分析条件 ，为进一步深入相关研究建立基础。 安卡鸡 F2代资源群血样 ，用经典酚一氯仿提取法提 取 DNA。 1 材料和方法 1．2．2 引物的设计与合成 Myf