现代色谱分析-LC幻灯片.ppt

薄层色谱基本操作 1.制板 2.点样 3.展开（develop) 显色 develop 薄层扫描法 双光束双波长扫描仪示意图 峰面积与样品量的非线性关系 根据Kubelka-Munk理论计算的A－KX曲线 扫描方式 纸色谱法（paper chromatography) 以分配色谱为主 样品极性越强，Rf越小 流动相极性降低，Rf增大 操作方式与TLC相同 不能用腐蚀性显色剂 Thank you 第二章 液相色谱法 第一节 柱色谱法 色谱分离过程在一根色谱柱中进行的方法。柱色谱法是最早出现的色谱法，当前仍然是重要方法。 按分离机制，分为吸附、分配、离子交换、分子排阻、亲和色谱法。 一.吸附柱色谱法(adsorption chromatography) 以吸附剂为固定相的色谱法。 吸附：溶质在两相界面上聚集、浓缩。 吸附剂：表面存在吸附活性中心。 Xm + Ya Xa +Ym 吸附等温线：三种形状，线性、Langmuir等温线、反Langmuir等温线。 色谱峰形状：对称，拖尾，前延。 影响色谱峰形状的因素：加样量，吸附剂活性 常用的吸附剂 硅胶（Silica gel)：适合大多数化合物 氧化铝（Alumina):中性，酸性，碱性 聚酰胺(polyamide)：氢键型，特别适合于黄酮类化合物的分离 硅藻土 硅酸镁 纤维素 吸附剂的活性 硅胶、氧化铝的活性与含水量有关； 活性分为5级，以Brockmann法测定； 活化（activation)与脱活化(deactivity) 聚酰胺的预处理 吸附剂的选择 常用溶剂的极性顺序 石油醚＜环乙烷＜四氯化碳＜苯＜甲苯＜已醚＜氯仿＜醋酸乙酯＜正丁醇＜丙醇＜乙醇、甲醇＜水。 二.分配色谱法(partition chromatography) 三.离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC) 离子交换树脂 强酸型 SO3+H- 弱酸型 COOH OH 强碱型 NR3＋X- 弱碱型 NH2 NHR 树脂性能 交换容量 交联度 粒度（目，mesh) 四.分子排阻色谱法（molecular exclusion chromatography,MEC) 也称凝胶色谱(gel chromatography), 空间排阻色谱法（steric exclusion chromatography) 凝胶过滤(以水为流动相） 凝胶渗透（以有机溶剂为流动相） 五.亲和色谱法(affinity chromatography) 选择性结合 固定相 基体 间隔臂 配位体 基体 1 天然有机高聚物 （1）葡聚糖（Dextran) Sephadex系列 （2）琼脂糖（Agarose) Sepharose系列、Bio-Gel A系列 2 合成有机高聚物 （1）聚丙烯酰胺及其衍生物 Bio-Gel P系列 （2）甲基丙烯酸酯共聚物 Sephacryl系列 3 无机材料 SiO2 ZrO2 TiO2 生物特效亲和色谱法 利用生物活性物质分子之间存在的可逆的、特效的识别功能建立的亲和色谱法。 生物特效配位体：氨基酸，肽，抗体，抗原，蛋白质；核碱，核苷，核苷酸，辅酶，核糖核酸，脱氧核糖核酸；细胞等。 染料配位亲和色谱法 利用生物分子与三嗪和三苯甲烷染料间的特效性相互亲和作用。 应用对象：核碱、核苷、核苷酸、蛋白质、酶 定位金属离子亲和色谱法 将具有螯合作用的有机官能团键合在间隔臂上，然后与Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+等金属离子生成稳定的螯合物，利用螯合物中定位的金属离子与生物分子的特效亲和作用实现生物分子的分离纯化。 应用对象：肽、蛋白质、核酸、生物酶 包合配合物亲和色谱法 利用生物分子与环糊精、冠醚、杯环芳烃及其衍生物之间的特效性包合作用。 应用对象：手性氨基酸、多肽、生物酶纤维细胞生长因子、凝固因子、脂蛋白及手性药物。 电荷转移亲和色谱法 利用生物分子与卟呤（酞菁）衍生物之间的电子给予和电子接受基团之间的特殊静电吸引亲和作用。 应用对象：氨基酸、蛋白质、核碱、核苷酸 共价亲和色谱法 共价配合是一种特殊的生物选择性吸附作用，它利用含二硫桥键（－S－S－）的配位体与含巯基的生物活性分子的共价键合。在较温和的反应条件下，此共价键合是可逆的。该法主要用于含硫多肽和含硫蛋白质的分离。 薄层色谱法 分离原理同柱色谱法 特点：快速，灵敏，高选择性，显色方便 定性参数 比移值 RfA=a/c RfB=b/c 吸附剂 硅胶（silica gel): 硅胶H，硅胶G，硅胶HF254，硅胶GF254, 硅胶HF254＋365， 氧化铝（al