第3章节基因工程制药技术幻灯片.ppt

三、酵母细胞中的基因表达与调控 2. 影响目的基因在酵母中表达的因素 目的基因的拷贝数 目的基因的表达效率 目的蛋白的糖基化 宿主菌的影响 四、动物细胞中的基因表达与调控 哺乳动物细胞表达系统的优势 哺乳动物细胞表达系统的应用成果 四、动物细胞中的基因表达与调控 1. 动物细胞内对真核基因的表达调控 转录水平的调控 顺式作用元件 反式作用因子 转录后水平的调控 翻译水平的调控 四、动物细胞中的基因表达与调控 2. 哺乳动物细胞表达系统常用的选择标记基因 胸苷激酶基因 二氢叶酸还原酶基因 新霉素抗性基因 四、动物细胞中的基因表达与调控 3. 哺乳动物细胞表达系统常用的表达载体 质粒型表达载体 病毒型表达载体 整合型表达载体 游离型表达载体 瞬时表达载体 稳定型 非复制性HSV-1病毒载体 裂解性HSV-1病毒载体 感受态细菌(competent cell): 系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，这时的细菌就称为感受态细菌。 一、转 化 （一）感受态细菌的制备： 用冰预冷的CaCl2处理细菌：即用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。 此时细菌膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面。 （二）DNA进入细胞： 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。 然后将细菌接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。 这时可挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。 二、λ噬菌体转染受体细胞 λ噬菌体能将自身的DNA分子注入到宿主细胞内，但DNA分子必须被λ噬菌体的蛋白包装形成成熟的噬菌体颗粒以后才能完成感染过程。因而应用λ噬菌体载体转导外源DNA必须先完成体外包装。 体外包装(in vitro packaging)是指在离体条件下，将提取的包装蛋白与DNA混合，产生噬菌体颗粒的过程。 通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程称为转导(transduction)，而通过转导接受外源DNA的细胞称为转导子(transductant)。 第六节 阳性重组子的筛选和鉴定 一、根据遗传表型筛选 二、应用限制性内切酶酶切分析筛选 三、核酸探针筛选 四、PCR筛选 五、菌落原位杂交技术 一、根据遗传表型筛选 1．抗生素平板筛选 2．?互补筛选 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选 1．抗生素平板筛选 大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。 但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。 同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含有两个抗药性基因的载体中，通过插入插入失活其中一个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选阳性重组子。 Ampicillin resistant? yes yes Tetracycline resistant? No yes B X B B B X Ampr ori Ampr Tcr ori pBR322 Ampr Tcr ori Screening by insertional inactivation of a resistance gene Replica plating: transfer of the colonies from one plate to another using absorbent pad or Velvet (绒布). transfer of colonies +ampicillin + ampicillin + tetracycline these colonies have bacteria with recombinant plasmid 2．?互补筛选： 利用?-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒常采用?互补筛选。载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码?-半乳糖苷酶N末端145个氨基酸的序列（?亚基）。用IPTG可诱导这个片段的合成，合成的片段能与宿主编码的?-半乳糖苷酶C末端序列（?亚基）进行基因内互补，恢复该酶