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生物化学 基因工程基本原理 第十五章 基因工程基本原理 一、基因工程的定义及主要内容 二、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 三、克隆基因的表达 四、基因工程的成就和展望 一、基因工程定义及主要内容 基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分子克隆 是指利用DNA重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的微生物等 是生物工程的重要内容之一 一、基因工程定义及主要内容 主要步骤: 1、构建DNA重组分子 2、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 3、基因的表达 构建DNA重组分子 工具酶 目的基因的制备 克隆载体 DNA分子的体外重组 工具酶 限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶 DNA连接酶(DNA ligase)、DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymeraseⅠ)、末端转移酶(terminal transferase)、逆转录酶(reverse transcriptase)、核酸酶S1(nuclease S1)和核酸外切酶Ⅶ(exonucleaseⅦ) 限制性核酸内切酶 能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶 限制性核酸内切酶 由Smith在1970年从流感噬血菌中发现 细菌体内有特异的限制修饰系统,这种修饰系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身DNA的特异识别序列处进行甲基化修饰,从而与外源DNA相区别。这样,限制性核酸内切酶就能去切割破坏外源DNA,而对本身无影响。 目前已从原核生物中分离出400～500多种限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性内切酶可识别4或6个特异核苷酸序列 粘性末端:指限制性内切酶的切割部位不在识别序列的中心轴,在断段产生一个短的单股突伸出来的不齐末端。 钝性末端:指限制性内切酶的切割部位在识别序列的中心轴处,即产生平齐末端。 几种限制性内切酶的作用位点 几种限制性内切酶的作用位点 目的基因的制备 目的基因就是所需要克隆的外源基因 制备方法: 1、人工合成法 2、逆转录法 3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中分离 4、用PCR法扩增目的基因片段 目的基因的制备:人工合成法 较小分子基因可用人工化学合成的方法获得 DNA化学人工合成的方法已经自动化 人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的 缺点是:1、不能合成太大的基因;2、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难;3、费用较高 目的基因的制备:逆转录法 若所需基因较大,人工合成有困难,从组织中分离提取也不容易,则可利用逆转录法合成。 该法是:以编码某特异多肽的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下反转录成该多肽mRNA的互补DNA(cDNA);再以cDNA为模板,在逆转录酶或DNA聚合酶I(或其KIenow片段)作用下,最终合成编码该多肽的双链DNA(dsDNA)。 可用于真核生物目的基因的获得 目的基因的制备:逆转录法 目的基因的制备:逆转录法 用逆转录法合成cDNA的主要问题是: 1、mRNA必需提得很纯 2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物, 3、以单链cDNA为模板往往难以合成与单链cDNA一样长的ds－cDNA,这与实验技术有关。 用限制酶切法直接从染色体DNA中分离 此方法主要适用于制备原核基因 对于物理图谱已清楚的原核基因,可用限制酶把目的基因切出来 鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分离纯化出的方法,即把包括目的基因在内的全部DNA片段插入到载体DNA(如pBR322)中,转化大肠杆菌,做成基因文库。再用目的基因的转录产物作探针,通过分子杂交,选择出含有所需基因的DNA片段。 用限制酶切法直接从染色体DNA中分离 此方法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因一样,也具有间隔顺序。 此方法的缺点是:由于含有插入顺序,原始转录本不能被原核细胞识别,并将插入顺序切除,以形成成熟转录本,因此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白质。 用PCR方法扩增目的基因片段 PCR是聚合酶链反应的缩写 是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术 在有少量DNA模板、引物、四种dNTP、TaqDNA聚合酶、合适的缓冲系统下,通过仪器控制DNA变性、退火及延伸的温度与时间,来合成新的DNA链,新合成的DNA链又可作为下一轮循环的模板。理论上经n次循环后,DNA链可达2n 用PCR方法扩增目的基因片段 克隆载体 目的基因若无合适的载体协助,就很难进入受体细胞; 为了保证目的基因能够繁殖,必需将它与载体连接 理想的载体 1、较小的、能进行复制的分子,具有高拷贝数 2、具有较少的限制酶的切点,最好是单一切割点,以便所要克隆的DNA片段能被插入载体 克隆载体 克隆载体 克隆载体 常用的克隆载体有:质粒、噬菌体及病毒 质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状双链DNA。质粒