RealtimePC R从原理到实验方法及数据分析.pdf

Real-time PCR Xiao Jin Applied Specialist Molecular Cellular Biology Real-time PCR 原理 数学原理 化学原理 Real-time PCR 应用 绝对定量 相对定量 等位基因分型 阴阳性判定 microRNA 荧光定量PCR数学原理 基线 阈值 Ct值 [DNA]0 由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品 扩增结果存在很大的差异 同时扩增96的相同样品的结果 扩增曲线：四个阶段 线 性 平台期 图 谱 线性增长期 指数增长期 基线期 平台期 对 线性增长期 数 指数增长期 图 谱 基线期 基线 阈值 Ct值 [DNA]0 什么是基线？ 基线就是扩增曲线中的水平部分。 线性图谱 对数图谱 基线 阈值 Ct值 [DNA]0 什么是阈值？ 1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值= 基线（背景）信号标准偏差x 10 。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5 。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。 基线 阈值 Ct值 [DNA]0 什么是C 值？ T 从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 线性图谱 对数图谱 C 值 C 值 T T 为什么C 值∝[DNA] ？ T 0 n N：产物分子数；N ：起始分子数 N = N0 x (1+e) 0