[医学]高效液相色谱法8章.ppt

高效液相色谱法 主讲人:张玉萍 一、色谱法的起源和发展 1906年:俄国植物学家M.Tswett首次提出色谱法 1940年:英国科学家Martin和Syngr提出了液-液分配色谱法 1952年:James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气-液色谱方法,即气相色谱法 1957年:Golay开创了毛细管柱气相色谱法 色谱法的起源和发展 60年代:出现了高效液相色谱 80年代初:出现了超临界流体色谱法 80年代末:出现了毛细管电泳色谱法 二、高效液相色谱法分类 　按分离机理不同分为以下几类: 　（一）吸附色谱法 　（二）液－液分配色谱法 　（三）离子交换色谱法 　（四）尺寸排阻色谱法（空间排阻色谱法） 　（五）亲和色谱法 　（六）手性色谱法 （一）吸附色谱法 　　　适合于分离相对分子质量中等的油溶性样品，在常用的几种高效液相色谱法中，吸附色谱法是分离异构体的最好方式。 （二）液－液分配色谱法 　　　按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法可分为： 　　　１.正相分配色谱法 　　　２.反相分配色谱法 １.正相分配色谱法 　　　流动相极性小于固定相极性，称为正相分配色谱法 。它对于极性强的组分有较大的保留值，常用于分离强极性化合物。 　　　 ２.反相分配色谱法 　　　　流动相极性大于固定相极性的称为反相分配色谱法 ，适合于分离弱极性的化合物。 　　　 （三）离子交换色谱法 　　　离子交换色谱法是以离子交换剂为固定相，用缓冲液为流动相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离。 　　　 （四）尺寸排阻色谱法　　　（空间排阻色谱法） 　　　尺寸排阻色谱法是用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。 　　　 （五）亲和色谱法 　　　　亲和色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从生物样品中分离和分析一些特征物质的色谱方法。 　　　 （六）手性色谱法 　　分离对映体的色谱法成为手性色谱法。 　　１.手性固定相拆分法 　　２.手性流动相拆分法 　　 三、高效液相色谱仪 　仪器组成： 　　　主要由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统、数据处理系统组成。 ＨＰＬＣ仪器结构图 岛津ＬＣ－２０１０型高效液相色谱仪 PLSA_Alliance2996型高效液相色谱仪 （一）流动相输送系统 　 　　１.　贮液瓶 　 　　２.　脱气装置 　常用的脱气方法有如下几种： 　　　（１）超声波振动脱气 　　　（２）抽真空脱气 　　　（３）加热回流脱气 　　　（４）吹氦脱气 　　　（５）真空在线脱气 （一）流动相输送系统 　３.　输液泵 　目前多用柱塞往复泵 （一）流动相输送系统 （二）进样系统 　　　常用进样器为六通进样阀及自动进样装置。 六通阀进样示意图 （二）进样系统 　　　自动进样装置采用微处理机控制进样阀采样（通过阀针）、进样和清洗等操作。 （三）色谱分离系统 　　　色谱分离系统包括保护柱、色谱柱、恒温装置和连接阀等。 （三）色谱分离系统 １.保护柱 ２.色谱柱　按规格不同分为分析柱和制备型两类。 　分析型柱：内径2～4.6mm，柱长10～25cm； 　制备型柱：内径20～40mm，柱长10～30cm。 （三）色谱分离系统 ３.恒温装置　 柱温是液相色谱的重要参数，精确控制柱温可提高保留时间的重 　现性。液相色谱常用柱温范围为室温至65℃。 ４.连接阀 （四）检测记录数据处理系统 　　　　理想的检测器应具有灵敏度高、响应快、重现性好、线性范围宽、使用范围广、死体积小、对流动相流量和温度波动不敏感等特性。 ＨＰＬＣ常用检测器 １.　紫外检测器 ２.　蒸发光散射检测器 ３.　 荧光检测器 ４.　HPLC-MS联用 ５.　其他检测器 　包括示差折光检测器、电　 　　化学检测器、化学发光检测器等 常用检测器 　１.　紫外检测器 　　　紫外检测器是HPLC应用最普遍的检测器，主要用于具有π-π或者是p-π共轭结构的化合物。 　　　（１）可变波长型检测器 　　　（２）光电二极管阵列检测器 　　　 常用检测器 １.　紫外检测器 　　（１）可变波长型检测器 　　　选择样品的最大吸收波长为检测波长，以增加检测灵敏度。 常用检测器 １.　紫外检测器 　（２）光电二极管阵列检测器 　　　其中二极管阵列检测元件可由1024（512或211）个光电二极管阵列组成，可 　同时检测190～800nm全部紫外光和可见 　光的波长范围内的信号。 光电二极管阵列检测器光路示意图 常用检测器 　２.　蒸发光散射检测器　　 　　　通用型的质量检测器。 　　　对所有固体物质（检测时）均有几乎相等的响应，检测限一般为8～10ng，可用于挥发性低于