水产动物疾病防治--项目八-水产动物疾病检查与诊断技术樊敏欢1.ppt

②间接凝集试验 常用的载体有绵羊红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等。抗原多为可溶性蛋白质，如细菌裂解物或浸出液、病毒、寄生虫分泌物、裂解物或浸出液，以及各种蛋白质抗原。应用较多的是间接血凝试验和乳胶凝集试验，即以红细胞或乳胶颗粒为载体，将可溶性抗原或抗体致敏于红细胞或乳胶颗粒表面，用于检测相应抗体或抗原。 (2)免疫标记抗体技术 主要有免疫荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验等，具体同病毒性疾病的血清学检测。 四、药物敏感性试验 在确定病原菌后，临诊上按常规用药又没有明显疗效时，有必要做抗菌药物敏感试验。药物敏感试验简称药敏试验（或耐药试验）。旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验。其大致方法是：取含致病菌的液体培养基均匀涂布在固体培养基上，同时将分别沾有一定量各种抗生素的纸片贴在培养基表面，培养一定时间后观察结果。由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现不同大小的抑制病菌生长而形成的“空圈”，称为抑菌圈。抑菌圈大小与致病菌对各种抗生素的敏感程度成正比关系。近年已有自动化的药敏试验仪器问世，使试验更加迅速、准确。 任务8-3 细菌性疾病的诊断与病毒的检测 二、病毒检测方法 1、根据症状诊断 2、组织学检测 3、电镜检查 4、试剂盒等快速诊断 一、病料的采集与准备 一般采集濒死或者出现临床症状的水生动物的组织病料，最好在鱼样本采集之后24h内进行病毒的提取，如果温度保持0~4℃在48h以内也可以。把临床样本冷冻贮存在-80~-20℃，可以保存更长时间，但要避免样品的反复冻融。要对已发生的疾病进行诊断，建议最少采集100个幼体标本，50个后期幼体，10个稚体或成体标本。如果临床症状明显，可采集更多的数量。 病毒性疾病的诊断 二、病毒的分离鉴定 1.病毒的分离与培养 细胞培养是用于鱼类病毒分离与培养最常用的方法，不同病毒有不同的敏感细胞系，但对于虾蟹类和贝类病毒而言，目前还没有被正式确认的细胞系，因此，虾蟹类和贝类病毒的增殖培养，是用已知的易感宿主进行病毒的体内扩增。常用的鱼类细胞系，主要有鲤上皮瘤细胞（EPC）、大麻哈鱼胚胎细胞（CHSE-214）、胖头肌肉细胞（FHM）、虹鳟性腺细胞（RTG-2）、草鱼性腺细胞（CO）、草鱼肾脏细胞（CIK）、鲇性腺细胞（CCO）、蓝太阳鱼鳃细胞（BF-2）、锦鲤鳍条细胞（KF）、鲈鳍细胞（GF）、鲤脑细胞（CCB）等。 （1）病毒的提取 用研钵、研杆或电搅拌器将样品匀浆成糊状，按1∶10的最终稀释度重悬于培养液中，于2~5℃下在冷冻离心机中2000~4 000g，离心15min，收集上清液，加入抗生素。 （2）细胞的接种 接种用的细胞必须是24h之内培养的单层细胞。接种量和培养基的容量比例约为1∶10，在40~150倍的显微镜下定期观察是否出现CPE（细胞病变效应），如果观察到明显的CPE，可进一步进行病毒的鉴定。 CPE（细胞病变效应） 2.病毒的鉴定 （1）病毒形态学鉴定 可通过电子显微镜观察病毒的形态和大小。 （2）病毒的血清学鉴定 病毒分离后，可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体，对病毒株进行血清学鉴定，以确定病毒的种类、血清型及其亚型。 （3）分子生物学鉴定 可采用PCR技术扩增病毒的特定基因，也可采用核酸杂交技术，鉴定分离的病毒。 三、病毒感染单位的测定 测定样本中病毒浓度，即病毒滴度，是病毒学中最重要的技术之一。常用于病毒滴度测定的技术，有空斑试验、终点稀释法、荧光-斑点试验和转化试验等，最常用的是前两者。 1. 空斑试验 空斑试验是一种可靠的病毒滴度测定方法，通过病毒接种细胞上覆盖琼脂限制病毒自由扩散，使病毒只限于感染周围细胞，形成感染病毒的斑点即空斑。通过中性红或结晶紫对感染细胞染色，活细胞可着色，病毒感染死亡细胞则因不能着色而形成透明空斑。根据待测样品的稀释度和空斑数，可计算出单位体积病毒液的空斑形成单位（PFU），得到病毒滴度。 空斑试验是纯化和滴定病毒的重要手段，但有些病毒或毒株不能形成空斑，不适用于空斑测定。 空斑试验 2. 终点稀释法 终点稀释法是用确定病毒对动物的毒力和滴度的重要方法，可测定几乎所有种类的病毒，包括某些不能形成空斑的病毒。通常可选择4~6个稀释度，接种一定数量的细胞、鸡胚或实验动物，每个稀释度做3~6个重复。 采用细胞培养测定病毒时，一般用半数感染量（TCID50）作为病毒感染的滴度；用鸡胚或动物测定时，可测定半数致死量（LD50；对于水生动物病毒，一般采用半数致死量（LD50）和半数感染量（TCID50）作为病毒滴度的测定方法。 四、病毒感染的血清学诊断