实验八 重组子的筛选和鉴定.ppt

主讲人：王兴平 E－mail：nwsuafwxp@163.com 主讲人：王兴平 E-mail: nwsuafwxp@163.com 基因工程实验 重组子的筛选和鉴定 一、实验目的 熟悉α互补筛选的原理 掌握重组子筛选的方法 掌握重组子鉴定的方法 二、实验原理 利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。 主要是利用PCR原理或者α互补原理，进行重组子的筛选。 α 互补的筛选 三、实验器材、试剂 1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。 2.试剂：30%甘油、0.1M CaCl2、氨卞青霉素（Amp）水溶液、X-gal、IPTG水溶液、LB培养液、含Amp的LB固体平板 。 四、感受态细胞的制备 复苏Ecoli JM110菌株，于LB平板上划线接种，37℃培养9-10h。 挑单菌落接种于300mL LB液体培养基（三角瓶）中，37℃振荡培养5-6h，（或者取原菌1:100加入到LB中，37℃振荡培养3-4h）使细胞处于对数生长期（用紫外分光光度计测定菌至OD600值达到0.4-0.5）。 分装6大管，每管50mL，冰上预冷30min，4000转，4℃离心5min。 弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1M CaCl2（液体中有冰粒时效果最好），合为2管后，每管再补10mL 0.1M CaCl2至40mL，冰浴30min，4000转，4℃离心5min。 弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1M CaCl2后，重悬菌体沉淀，合为1管，冰浴10-15min，即得感受态细胞。 四、感受态细胞的制备 现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。 分装200管（每管200 ?l），投入液氮快速冷冻后，-70℃保存。 用标准质粒进行转化，若长出许多蓝斑菌落，证明感受态细胞的效价高。 四、感受态细胞的制备 1．重组子筛选（α互补） 五、重组子筛选与鉴定操作步骤 给4?l IPTG和40?l X-gal充分混匀后用三角玻棒均匀地涂布于含100?g/mL Amp的LB选择性平板上，然后涂布重组子菌液。 37度培养过夜。 将平皿放在4度冰箱内0.5h，待兰白斑现色明显。 白斑菌落即为阳性克隆的重组子。 2．重组子鉴定： 五、重组子筛选与鉴定操作步骤 菌液PCR （1）挑取白斑阳性克隆菌液，扩大培养。 （2）以菌液为模板，进行PCR反应。其PCR引物、反应体 系与反应条件与“目的基因分离”实验的条件相同。 （3）PCR产物进行电泳，有目的片段出现者为阳性克隆。