谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法.doc

谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法 1 主题内容与适用范围本标准规定了谷物及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法及免疫测定法(ELISA)的基本要求。本标准适用于谷物(小米、玉米、大麦等)及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。第一法的最低检出浓度为0.1mg/kg。第二法的最低检出浓度为0.1ng/kg。第一篇 薄层色谱测定法2 原理谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。3 试剂以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。3.1 三氯甲烷。3.2 无水乙醇。3.3 甲醇。3.4 石油醚(60～90℃或的30～60℃)。3.5 乙酸乙酯。3.6 乙腈。3.7 丙酮。3.8 异丙醇。3.9 乙醚。3.10 无水乙醚。3.11 氯化铝(AlCl3·6H2O)：化学纯。3.12 中性氧化铝：层析用，经300℃活化4h，置干燥器中备用。3.13 活性炭：20g活性炭，用3mol/L盐酸溶液浸泡过夜、抽滤后，用热蒸馏水洗至无氯离子，在120℃烘干备用。3.14 硅胶G：薄层层析用。3.15 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(以下简称DON)标准溶液，精密称取5.0mg DON，加乙酸乙酯－甲醇(19∶1)溶解。转入10mL容量瓶中，用乙酸乙酯－甲醇(19∶1)稀释至刻度，此标准溶液含DON0.5mg/mL。吸取此标准溶液0.5mL，用乙酸乙酯－甲醇(19∶1)稀释至10mL，此溶液每毫升含DON25?g。4 仪器4.1 小型粉碎机。4.2 电动振荡器。4.3 75mL玻璃蒸发皿。4.4 层析柱：内径2cm，长10cm，不具活塞。4.5 10mL具塞浓缩瓶：底部具0.2mL刻度尾管。4.6 玻璃板：5×20cm。4.7 薄层涂布器：0.3mm。4.8 展开槽：内长25cm，宽6cm，高4cm。4.9 紫外光灯：365nm。4.10 微量注射器：10?L、50?L。4.11 50mL平底管。4.12 双波长薄层扫描仪：带数据处理机。5 分析步骤5.1 提取称取20g粉碎样品置于200mL具塞锥瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷－无水乙醇(8∶2)，密塞。在瓶塞上涂层水，盖严防漏，振荡1h，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于75mL玻璃蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。5.2 净化5.2.1 液－液分配5.2.1.1 谷物：用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20mL(玉米样品用30mL)甲醇－水(4∶1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。5.2.1.2 谷物制品(蛋糕、饼干、面包等)：用100mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用30mL甲醇－水(4∶1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。振摇分液漏斗1.5min，静置约15min，使分层后，将下层甲醇－水提取液过柱净化，不要将两相交界处的白色絮状物放入柱内。5.2.2 柱净化5.2.2.1 小麦及其制品：在层析柱下端与小管连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性炭，敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放一平底管接受过柱液，将抽滤瓶接上水泵或真空泵，稍稍开启泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇水提取液小心地沿管壁加入柱内，控制流速为每15s 18～20滴(3mL/min)，甲醇－水提取液过柱快完毕时，加入10mL甲醇－水(4∶1)淋洗柱，抽滤，直至柱内不再有液体流出。过柱速度控制在2～3mL/min，速度太快净化效果不好，太慢耗时太长。5.2.2.2 玉米：同5.2.2.1，只是将活性炭的用量改为0.3g。5.3 制备薄层层析用样液将过往后的洗脱液倒入75mL玻璃蒸发皿中，用少量甲醇－水(4∶1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水浴上浓缩至干。5.3.1 小麦：趁热加入3mL乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾将残渣中的DON溶出，并将乙酸乙酯挥发至干，再加入3mL乙酸乙酯同样处理一次，将溶剂挥干，最后加3mL乙酸乙酯，加热至沸，放冷至室温后转入浓缩瓶中，再用三份1.5mL乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。5.3.2 小麦制品、玉米：趁热加入3mL乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾，将残渣中DON溶出，放冷至室温后转入浓缩瓶中。加约0.5mL甲醇－丙酮(1∶2)于蒸发皿中，用玻棒搅动