中国人群中KEL基因第7～9外显子相关抗原的分子分析.pdfVIP

摘要 摘要 Kell血型系统是非常复杂的血型系统，对白种人来说，在临床上的重要性仅 次于ABO血型系统和Rh血型系统。该血型系统已发现27种抗原，其中第8外 VLAN、KTIM、还有一种未命名的新抗原；第9外显子有2个点突变，编码2 种抗原，即KELl3、K22；不过目前还没有发现第7外显子是否发生点突变，是 否编码新的抗原。这些抗原中有的能引起严重的输血反应和新生儿溶血病 (HDN)。KEL基因在分子水平上具有高度多态性，且一般特征是单个碱基发生 改变导致单个氨基酸发生改变，导致抗原表达发生改变。 在本课题中，随机选取上海市血液中心2006年3月至2007年1月采集的正 常人的血样1015例，其中都是汉族人；另外还有2006年5月新疆地区献血员的 随机血样55例作为研究对象，对这些样品的KEL基因外显子7～9的多态性作 研究。其中这些样品的血液常规检测发现ABO血型正反定型无异常。因为缺乏 相应抗体，无法用血清学进行初筛，且没有阳性标本作对照，所以本实验的实验 线路是建立能具有大规模筛查能力的PCR．RF-SSCP方法研究／(．EL基因外显子 酶将PCR扩增产物酶切成两部份，以提高结果的分辩度和灵敏度；再用加热变 性、骤冷、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染对这些产物形成的单链构象的格局进行分 析。结果发现这些正常样品有两种正常格局，这与PCR．SSCP的试验特征有关。 随后以己知正常格局以及正常样品为对照，研究1070例随机样品，研究步骤与 已知是正常样品的研究步骤一致，将这1070例的样品的格局与正常格局比较一 致，挑选出异常格局的样品对其进行测序分析。结果发现这1070份样品中有3 ntl080G—A 个样品具有异常格局，经多次双向测序结果证实，一个样品Exon9 突变，该突变是同义突变，不改变氨基酸，将这碱基突变与GeneBank中的序列 比对，证实为一新KEL等位基因；第二个样品在内含子7的67位有个c—A的 突变，是新的SNP；第三个样品在Exon7发生nt835G—T突变，该突变使正常 的编码谷氨酸的密码子变成终止密码子，导致终止密码子提前成熟。将这三个碱 DQ923321和EF208901。 随后对Exon7nt835G—T发生突变导致正常的编码谷氨酸的密码子变成终 止密码子的先证者及其家系作一详细的血清学和分子生物学分析。通过血清学分 析技术、RT-PCR、常规PCR、直接测序及克隆测序等方法对其分子基础作了深 nt835位G 入了解。结果发现该样品的血清学结果表现出陆表型，除了Exon7 摘要 一T的杂合突变导致编码谷氨酸的密码子变成终止密码子外，在Exon3nt304位 插入了一个T，导致在外显子4里形成一个终止密码子，终止密码子提前成熟； 硒先证者的父亲在Exon7nt835位有相同的G—T的杂合突变，其血清学结果表 现为Kell抗原正常；硒先证者的母亲在Exon3nt304位具有相同的T插入；硒 先证者分别遗传了父母亲的无效的KEL等位基因。正是这两个杂合型的无效KEL 结果显示l(0先证者只有一个转录本，且该转录本缺失第3外显子，本试验未检 测到第7外显子发生碱基改变的转录本，该碱基突变引起终止密码子提前成熟可 能由于无义介导的mRNA衰退而易被快速的降解，从而难以被检测到；也不能 排除是由于能检测到的转录本为优势表达，阻挡了含第7外显子突变的转录本的 检测，这需要进一步的研究。l(0表现型非常罕见。其分子基础有的是纯合无效 突变，有的是杂合无效突变，本文的硒表现型的分子基础是杂合型的无效等位 基因。外显子3的T的插入基因结果提交GeneBank，获得基因序列号，即： EF208900。 关键词：KEL基因，PCR．RF-SSCP,RT-PCR，异源二聚体，克隆，测序 ABSTRACT Kellblood is a and inclinical group system impo