中国美利奴细毛羊BAC文库的混合及筛选.pdfVIP

摘 要 目的!本研究旨在将中国美利奴细毛羊基因组BAC文库分两级构建高质量的三维结构混合池， 同时设计一种高通量快速PCR筛选两级混合池的方法，为后续研究者从7．4万个克隆中快速筛选阳 性克隆，以用于绵羊基因组物理图谱的绘制和基因的图位克隆等研究，为其提供作图“试剂”和克隆 材料。 友洼!用等级混合法a血rarchical pooling 维一级混合池和二级混合池，一级混合池基于每4个384-well盘而构建，由相同的行、列分别构建 行列的一级混合池，每盘各构建一个盘的一级混合池；将构建好的盘一级混合池(168个)以12列 ×14行的方式排列，每行(或列)各构建盘的二级混合池，将行(或列)标号相同的一级混合池分 别混合成一个行(或列)的二级混合池。本研究中采用PCR方法筛选，采用一步筛选一个克隆或三 步筛选多个克隆的策略。第一步筛选盘、行和列的二级混合池，此时可以直接确定一个阳性克隆， 如果阳性克隆在两个以上，需采用三步筛选法，即阳性盘的确定和阳性盘中的阳性行、列的确定。 引物，用一步共66个PCR反应成功筛选到一个阳性克隆。用研究中设计的筛选方法筛选所构建的 混合池及 结途三-本研究所构建的混合池至少可满足300次PCR筛选所需。用本研究中设计的一步或三步 筛选策略可高效快速的筛选出大量阳性克隆，进而为绵羊基因组物理图谱的绘制和基因的图位克隆 等研究供作图“试剂”和克隆材料。 关键词：BAC文库，三维混合池，。高通量，筛选，绵羊 Abstract of aimofthis wastoconstructtwolevel basedthree·dimensionChinese ．Object：．The project pools finewoolmerino BAC thesame a PCR time，to sheep library,at designhigh—throughputrapidscreening methodtofindout clonesfrom ordertooffer and positive 74，000BACs，in mappingreagentscloning materialstothe and on clongingsheepgenome． physicalmappingmap-based Method： thehierarchical constuctedtwolevels witha strategies，we pools Uesing pooling schemeoftheBAC ofChinesefinewoolmerino three-dimensional library sheep．Theprimary pooling rowandcolumnwerebasedonthesamerowandcolumnof four384-wellmicrotiter pools every plates，the werebasedonallclonesofeach384-wellmicrotiter