高效液相色谱法测定血清中维生素A、E、β-胡萝卜素讲义幻灯.pptVIP

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2018-04-02 发布于天津
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高效液相色谱法测定血清中维生素A、E、β-胡萝卜素讲义幻灯.ppt

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高效液相色谱法测定血清中维生素A、E、β-胡萝卜素南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心一、原理本实验应用HPLC法测定人血清中维生素A、维生素E及β-胡萝卜素；血清样品用有机溶剂处理、提取后经HPLC色谱柱分离，根据保留时间和峰面积(或峰高)与标准比较，便可定性和定量。二、操作方法 1．样品处理血清样品在采血后立即离心，分离血清；置5ml塑料试管中，充氮、密封，于-40℃保存备用。在5ml棕色具塞玻璃离心管中，加入0.25ml血清、1ml 10％邻苯三酚乙醇溶液、0.5ml 60％KOH，用氮气将管内空气置换，37℃水浴1h；冷水浴3min后加入5％NaCl 1ml，己烷/乙酸乙酯(9:1)3ml，用氮气将管内空气置换，盖紧塞子，水平振荡器上振荡5min(40次/min)；将全部己烷/乙酸乙酯层转移至含1ml双蒸水的试管中，涡旋振荡器上振荡10s；精确吸取2ml已烷/乙酸乙酯层于另一5ml棕色具塞玻璃离心管中，氮气吹干，加入350μl甲醇，轻混至充分溶解，充氮气置冰箱待检测。吸取上清液时：注意不可触及界面；否则：一方面会吸入水，影响分析和柱的分离能力；另一方面，界面上的脂肪层可能会影响分析结果。在测定中，可用标准血清进行质量控制，保证测定结果的可靠性。标准血清至少要在测定开始和结束时各测定一次；当样品较多时，可隔若干个样(如12个)测定一次，最后取标准血清测定的平均值即可。