基因克隆的载体技术 培训.ppt

基因克隆的载体;; 载体(vector)是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分,通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面,而进行复制,作为基因工程的载体,必须具备以下几个性能: ;1、分子较小,可携带比较大的ＤＮＡ片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点,但每一种限制酶又要最少的切割位点(多克隆位点 multiple cloning sites ,MCS) 。 4、有适合的标记,易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达,并且尽可能是高效的表达。 6、从安全角度考虑,要求载体不能随便转移,仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 ;第一节 质粒(plasmid)载体  质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA,一般大小约106~108D,可自身复制和表达,有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因,所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。  作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的,目前已有多种经改造的良好的质粒载体。;　;质粒载体;一、质粒的生物学特性: 1、质粒DNA的构型: SC型 共价闭合环形DNA(cccDNA) OC型 开环DNA(ocDNA) L 型 线性DNA(cDNA) 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著: 106~108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分: 复制基因(replicator)、选择性记号、克隆位点 ;L;4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。 抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等 5、质粒DNA的类型: 接合型和非接合型;含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒;F因子和F`因子等。;6、质粒DNA的复制类型: 低拷贝的质粒(1～3):严紧型复制控制的质粒 (接合型) 高拷贝的质粒(10~60):松弛型复制控制的质粒(非接合型) 7、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞,一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下,两种亲源关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 质粒的不亲合性分子基础,主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。;;(二 ) 、质粒DNA的分离与纯化 1、氯化铯密度梯度离心法; 2、碱变性法; 3、微量碱变性法。 ;1.氯化铯密度梯度离心法 1、质粒DNA占总DNA的1﹪～2﹪; 2、在细胞裂解及DNA分离过程中,大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断,而质粒DNA分子量小,结构紧密仍保持完整的状态; 3、染色剂溴化乙锭(EB)能掺入到DNA链的碱基中,导致链的解旋;而且形成的EB- DNA复合物中,EB含量越高,密度会越低。;流程: 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠(SDS)来促进大肠杆菌的细胞裂解。 将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中,EB会嵌入到DNA链的碱基中去。 在EB达到饱和时,进行氯化铯密度梯度离心。 ;;;2.碱变性法: 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间,在拓扑学上的差异而发展出来的。 在PH值12.0～12.5范围内时,线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性PH值使之复性,线性染色体形成网状结构,而cccDNA可以准确迅速复性,通过离心去除线性染色体,获得含有cccDNA的上清液,最后用乙醇沉淀,获得质粒DNA;3.碱变性法: 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物,加在微量离心管中,离心收集细胞沉淀; 2、加入100微升冰冷的?液,(50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA,4~5mg溶菌酶)静置5分钟; 3、加入200微升微冷的?液(0.2NaOH,1.0﹪SDS)缓缓混匀置室温5分钟。 65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。 4、加入150毫升