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无 菌 检 查 法 生测室 一、无菌的概念 无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。对于任何一批灭菌产品来说，绝对无菌是既无法保证也无法被用试验来证实的，因为不可能对每一最小包装的产品进行无菌试验。事实上，在实际生产过程中，灭菌是指将物品中污染的微生物残存概率下降至一定水平，以无菌保证水平SAL (Sterility Assurance Level)表示。最终灭菌产品微生物存活的概率的无菌保证值一般不得高于 10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。 二、无菌检查法的应用 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 四、检验环境 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。 相关技术标准文件： 《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、沉降菌的测试方法》 五、无菌检查用培养基 无菌检查法是建立在污染样品的微生物能在规定的培养基中生长的基础上。因此，无菌检查用的培养基质量是无菌试验成功与否的关键因素。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。 常用的培养基 硫乙醇酸盐流体培养基（需气菌、厌气菌培养基）—可培养好氧菌、厌氧菌。 改良马丁培养基（真菌培养基）—可培养真菌 、好氧菌。 选择性培养基: 对氨基苯甲酸--磺胺类供试品 聚山梨酯80--用于非水溶性供试品 β-内酰胺酶--用于β-内酰胺类供试品 0.5%葡萄糖肉汤培养基--用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查。 培养基的制备 在制备培养基时，应选择质量符合要求的培养基组分或脱水培养基。脱水培养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求。 注意：硫乙醇酸盐流体培养基在制备时应加热至煮沸使溶解，只能煮沸一次 接种前：在供试品接种前，硫乙醇酸盐流体培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5。 培养后：培养结束后硫乙醇酸盐流体培养基氧化层（粉红色）不得超过培养基深度的1/2。 六、无菌检查培养温度 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。 改良马丁培养基置23～28℃培养。 七、培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。 本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 培养基的无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14天，应无菌生长。 培养基的灵敏度检查 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠球菌、黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察，空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均应生长良好。 八、无菌检查方法的验证 2000年版的中国药典无菌检查法的抑细菌和抑真菌的试验，其目的是采用直接接种法确定供试品是否具有抑菌作用。而2005年版验证试验的目的是确定供试品的无菌检查的方法，它既确定了该检验方法下供试品的抑菌性，又确定了适宜的检验方法和检验条件。 验证试验可在供试品的无菌检查之前或与供试品的无菌检查同时进行。当同时进行时，若验证试验失败，那么供试品的无菌检查结果是不成立的。 菌株选择的原则:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。 验证用菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、枯草杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。 加菌量:＜100cfu。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作试验。 对每一试验菌应逐一进行验证： 硫乙醇酸盐流体培养基 --金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌。 改良马丁培养基 --白色念珠菌 、黑曲霉。 试验组：供试品+菌 菌液组：菌 结果判定 试验组与阳性菌对照组对比，试验菌应生长良好，则供试品的检验量在该检验条件下无抑菌作用，或抑菌作用忽略不计。 如试验组任一容器中微生物生长缓慢或不生长，则应采取相应的方法消除其抑菌作用。 检验数量是指一次实验所用供试品最小包装容器的数量。 无菌检查法建立在批产品受微生物污染是均一的假设上，但是，即便整批产品非常均匀 ，检出低水平污染的几率也是很低的。因此检验数量越大，检查结果越准确，但检验数量增加时，也加大了无菌操作的工作量，以及加大了污染的风险。 除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。 一般情况下：供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小