家蚕（Bombyx mori）piggyBac转座子转基因载体的构建及转基因方法的研究.pdfVIP

家蚕(Bombyx 构建及转基因方法的研究 ‘生物化学与分子生物学专业 研究生王宇 指导教师李维 摘要 多种外源蛋白，特别是其丝腺能够产生大量的丝蛋白，而成为研究的热点。但 还存在许多不足，如外源基因的有效导入、整合、表达及转基因个体遗传稳定 性等问题，仍需进一步深入研究。首先，本研究构建了基于转座子piggyBac actin 的表达载体和辅助质粒。将家蚕细胞质肌动蛋白基因L43(cytoplasmic mori) 计了一个多克隆位点区，便于外源基因的插入。其次，从家蚕(Bombyx 品种菁松×皓月后部丝腺中提取总RNA，用RT-PCR扩增技术克隆到家蚕丝心蛋 白轻链cDNA，序列分析表明，该片段全长为798个碱基。比较4种不同品种来 源的家蚕丝心蛋白轻链基因外显子区域序列，同源性在98．0％-99．4％之间，推 测的氨基酸同源性在98．0％一99．6％之间，四个品种间发生的变异比较一致地集 中在不同位置的8个碱基上。提取家蚕品种菁松×皓月后部丝腺总DNA，利用 PCR扩增技术获得家蚕丝心蛋白轻链基因调控片段和终止子片段，长度分别约 为1．2kb和0．45kb，分别与J一139 L链基因相应区域进行比对，同源性高达 98．8％和99％。结果表明，启动子片段包含一些典型的调控元件和多个可能参与 丝蛋白基因特异性表达调控的元件，终止子片段包含有停止转录的信号序列， 这为构建家蚕丝腺特异性表达载体奠定基础。最后，利用本研究构建的家蚕转 基因载体进行了家蚕转基因的研究。分别用显微注射法、精子介导法、脂质体 受精卵中，用PCR方法对后代的检测中，发现后代个体染色体中含有gfp基因， 表明gfp基因已整合到家蚕基因组中且能稳定遗传，这为进一步研究将外源基 因导入家蚕，进行遗传改良和高效表达奠定了基础。 关键词：家蚕， 转基因 转座子piggyBac，’丝心蛋白轻链基因， ● ● II ConstructionofpiggyBacTransposon VectorandStudieson cMethods Transgeni of mori Bombyx andMoIecuIar Biochemistry BioIogy Master：Wangyu Tutor：Liwei Abstract moriiSan economicalinsect．At Bombyx important present， have it of researchersmadebecomebioreactorand kinds expressedmany lo